Mandens seksuelle lyst falder typisk med alderen. Vores forståelse af det neurobiologiske grundlag for dette fænomen er imidlertid begrænset af vores viden om hjernekredsløbet og neuronale veje, der kontrollerer mandlig seksuel lyst. En række undersøgelser på tværs af arter tyder på, at dopamin (DA) påvirker seksuel lyst. Her bruger vi genetiske værktøjer og adfærdsassays til at identificere en ny undergruppe af DA-neuroner, der regulerer aldersassocieret mandlig frieriaktivitet i Drosophila. Vi finder, at stigende DA-niveauer i en undergruppe af celler i PPL2ab-neuronklyngen er nødvendig og tilstrækkelig til øget vedvarende frieri hos både unge og gamle hanfluer. Vores resultater indikerer, at forebyggelse af det aldersrelaterede fald i DA-niveauer i PPL2ab-neuroner lindrer nedsat frieri-adfærd hos mænd Drosophila. Disse resultater kan danne grundlag for at tyde kredsløbet involveret i seksuel motivation hos manden Drosophila hjerne.

Dopamin (DA) spiller en vigtig rolle i motorisk kontrol¹, motivation^2,3, døgnrytme⁴, erkendelse^2,5 og belønning³. Reguleringen af ​​seksuel tilfredsstillelse af DA hos pattedyr er også blevet godt beskrevet^6,7,8. Ydermere kommer beviser for, at DA medierer regulerer menneskelig seksuel adfærd, fra tilfælde af utilsigtet hyperseksualitet som følge af DA-behandling hos patienter med Parkinsons sygdom⁹. På trods af disse fremskridt i vores forståelse af DAs rolle i at kontrollere seksuel lyst hos pattedyr, er det neurobiologiske grundlag for dette fænomen på celle- og kredsløbsniveau begrænset.

Seksuel funktion falder typisk i høj alder^10,11,12. Aldring er karakteriseret ved fysiologiske, patologiske, adfærdsmæssige og psykosociale ændringer. Alle disse faktorer påvirker seksuel funktion, og det er vanskeligt at skille deres individuelle virkninger ad. De cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for seksuel tilbagegang med alderen, har været svære at studere og forbliver dårligt forstået. Fremskridt inden for genetiske og adfærdsmæssige værktøjer til rådighed for studier Drosophila, kombineret med en mere detaljeret forståelse af Drosophila frieri, har nu givet kraftfulde metoder til at studere væsentlige funktioner og regulerende mekanismer for seksualitet hos disse dyr.

Tidligere undersøgelser vha Drosophila demonstrere, at forskellige fysiologiske funktioner inklusive frieri adfærd påvirkes af aldring^13,14,15. I Drosophila hjerne, der er -280 DA neuroner, hvis cellelegemer er organiseret i mindst 13 klynger¹⁶. Vi antog, at disse DA-neuroner ville indeholde underpopulationer, der regulerer seksualitet og dermed ville give en stærk model til at forstå, hvordan mandlige seksuelle reaktioner reguleres af DA-baner i hjernen i løbet af levetiden. Her demonstrerer vi, at DA-niveauer i den protocerebrale posteriolaterale dopaminerge klynge-neuron 2ab (PPL2ab) regulerer mandlig frieri, og at tyrosinhydroxylase (TH), et enzym, der er ansvarlig for DA-syntese, niveauer i disse celler falder med alderen. Interessant nok påvirkede ændring af DA-niveauer i specifikke PPL2ab-neuroner ikke motorisk aktivitet, sensorisk behandling (inklusive lugt og smag) eller levetiden, hvilket tyder på, at PPL2ab-neuroner specifikt regulerer mandlig seksualitet. Sammen antyder vores resultater en neurobiologisk mekanisme for faldet i seksualitet ved aldring og fremmer vores forståelse af, hvordan hjernen regulerer mandlige libidoniveauer og seksuel motivation.

PPL2ab-neuroner regulerer seksualitet hos hanfluer

For at bestemme de specifikke DA neuroner, der regulerer Drosophilafrieri, vi brugte Gal4-drivere til at manipulere DA-aktivitet i begrænsede grupper af DAergiske neuroner i fluehjernen (Supplerende Fig. 1; murashka-1-Gal4 chauffør ind Fig. 2a; og opsummeret i Supplerende tabel 1). Vi analyserede derefter effekten af ​​celletype-specifik DA-overekspression på frieriintensitet hos hanfluer (Fig 1). Vores resultater afslørede, at øget ekspression af TH i TH-Gal4-(Ref. 17) og TH-C1-Gal4-positiv¹⁸ neuroner forbedrede markant det mandlige frieri-indeks (Fig 1). Interessant nok observerede vi lignende resultater ved at overudtrykke TH i murashka-1-Gal4-positive neuroner, som retter sig mod en mere begrænset cellepopulation (Fig 1). At mærke de celler, der er målrettet efter TH-Gal4, TH-C1-Gal4 , murashka-1-Gal4, vi krydsede hver linje til UAS-mCD8::GFP reporterlinje og modfarvet hver af TH immunhistokemi. Ved at vurdere den anatomiske profil af TH-celler, der co-udtrykker GFP i hver linje, fandt vi, at ekspression overlappede mellem de tre Gal4-drivere i en undergruppe af DA-neuroner i PPL2ab (Fig. 2a1 , Supplerende Fig. 1g1) og den protocerebrale posteriomediale dopaminerge klynge-neuron 1/2 (PPM1/2) (Fig. 2a2 , Supplerende Fig. 1g3). Disse data antydede, at intensiteten af ​​mandlig frieri kunne være reguleret af DA-frigivelse fra disse neuroner.

For at afklare, om PPL2ab- eller PPM1/2-neuroner er involveret i mandlig frieri-adfærd, undersøgte vi effekten af ​​selektivt at overudtrykke TH og GFP fra to Gal4-drivere og en LexA-driver udtrykt i disse regioner. Det fandt vi NP3024-Gal4 , NP5945-Gal4 blev delvist udtrykt i PPL2ab- og PPM1/2-klyngerne (Fig. 2b, c), mens LG121-LexA blev kun udtrykt i PPL2ab klyngen (Fig. 2d). Vi observerede, at cellelegemerne af PPL2ab-neuroner mærket af disse drivere var placeret på den laterale kant af protocerebrum nær de optiske lapper (angivet med pile i Fig. 2a – d), og projiceret opadstigende neurale fibre til bægeret (CX) og det laterale horn (LH). TH-positive PPL2ab-neuroner blev mærket af fire uafhængige drivere, der blev brugt i denne undersøgelse (murashka-1-Gal4, NP5945-Gal4, NP3024-Gal4 , LG121-LexA) (Fig. 2a1-d1), og det er vigtigt, at ekspressionsmønstrene for disse fire drivere kun overlappede i PPL2ab-neuroner. For at bestemme, om disse PPL2ab-neuroner regulerer frieri-adfærd, overudtrykte vi TH ved hjælp af hver driver og udførte adfærdsassays. Vi observerede en signifikant stigning i frieriindekset og længden af ​​frierikampen mod enten intakte eller halshuggede (det vil sige immobiliserede hunner) målkvinder i alle linjer (envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys test, P<0.05) (Fig. 2e, f). Brugen af ​​halshuggede målkvinder giver en metode til at evaluere, om mandlig seksuel tiltrækning og forbedret frieri er reguleret af øgede DA-niveauer i PPL2ab-neuroner. Ved at bruge en immobiliseret kvinde fjernede vi de gensidige virkninger af mandlig-kvinde interaktioner. Vores resultater viser derfor, at PPL2ab-neuroner specifikt påvirkede mandlig frieriintensitet gennem DA snarere end deres tiltrækningskraft.

Der er cirka seks neuroner i PPL2ab klyngen i hver hjernehalvdel, hvilket i tidligere undersøgelser¹³ er blevet klassificeret i mindst fire undertyper baseret på deres fiberinnerveringer. To undertyper af PPL2ab-neuroner projicerer til den ipsilaterale CX og LH; den ene innerverer hele LH, mens den anden kun innerverer den ventrale del. En anden undertype innerverer lobulaen og udvider en dorso-medial gren, der bevæger sig langs det posteriore optiske spor (POT) og forgrener sig nær den dorsale ende af spiserøret. Den resterende subtype innerverer den posteriore laterale protocerebrum¹³. Blandt de PPL2ab-driverlinjer, vi brugte, tre (NP3024-Gal4, NP5945-Gal4 , LG121-LexA) udviste tydelige POT-sporudtryksmønstre (angivet med pilespidser i Fig. 2b-d), mens murashka-1-Gal4 kom ikke til udtryk i POT. Dette indebar, at PPL2ab-innerveringer af POT kan være unødvendige for at regulere mandlig frieriintensitet.

For at bekræfte, hvilke andre undertyper af PPL2ab-neuroner, der sandsynligvis er nødvendige for opretholdelse af mandligt frieri, murashka-1-Gal4 linje blev brugt til at køre UAS>CD2,y⁺>CD8::GFP transgen kombineret med en Hs-flp transgen. To forskellige undertyper af PPL2ab neuroner i murashka-1-Gal4 blev dechifreret i flip-out kloner (Fig. 2g, h). En af klonerne indeholdt celler med opstigende grene af neuritter, der innerverede CX, og en anden gren af ​​neuritter, der innerverede hele LH og superior mediale protocerebrum (Fig. 2g; Supplerende film 1). En anden klon af celler projicerede en gren af ​​primære neuritter til CX og en anden gren til den tilstødende posterior inferior laterale protocerebrum og den ventrale del af LH; en tredje gren projicerede medialt og innerverede den midterste inferior mediale protocerebrum (Fig. 2h; Supplerende film 2). Når de betragtes i sammenhæng med vores adfærdsmæssige resultater, indikerede disse anatomiske ekspressionsdata, at de forhøjede DA-niveauer fremkaldte i en undergruppe af murashka-1-Gal4 at udtrykke PPL2ab-neuroner i disse regioner var forbundet med opretholdelse af frieri hos unge voksne fluer (10 dage gamle).

DA-niveauer påvirker opretholdelsen af ​​frieri hos ældre fluer

Alderdom er et fænomen, der involverer et fald i fysiologiske funktioner over tid på grund af de skadelige bivirkninger af de kontinuerlige metaboliske reaktioner i en levende krop. Det er blevet rapporteret, at aldring påvirker seksualitet og seksuel lyst¹⁰. At afgøre, om frieri opretholdelse ændres som Drosophila alder, analyserede vi frieriadfærd hos vildtype Canton S (CS) hanner i forskellige aldre (5-60 dages alderen) og fandt ud af, at det maksimale frieriindeks og frieri-længde fandt sted i en alder af 10 dage hos voksne hanner (Supplerende fig. 2a, b). Resultaterne afslørede også, at frieriets opretholdelse gradvist faldt over aldring fra det maksimale ved 10 dage gammel. I betragtning af at motorisk aktivitet og frieriaktivitet er intimt relaterede, undersøgte vi derefter motorisk aktivitet forbundet med alder hos fluer. Negativ gravitisk adfærdsanalyse (et klatreassay)¹⁹påvist, at klatreaktiviteten fortsætter i det meste af levetiden, før den falder hos 50 dage gamle hanfluer (Supplerende fig. 2c). Vi brugte Drosophila aktivitetsovervågning (DAM) system²⁰ at registrere spontane motoriske aktiviteter hos 10- og 40-dage gamle mænd i 24 timer og demonstrerede, at der ikke var nogen signifikante forskelle observeret mellem de to grupper (Supplerende fig. 2d). Der blev imidlertid observeret en mere end 10 gange reduktion af DA-niveau i vævsprøver af hovedet på 40 dage gamle mænd sammenlignet med 10 dage gamle modne mænd (Supplerende fig. 3a, b). Vi bekræftede derefter ved TH-immunfarvninger, at TH-proteinniveauer blev reduceret i PPL2ab-neuroner hos ældre mænd (Supplerende fig. 3c). Derudover var antallet af PPL2ab-neuroner det samme i gamle fluer, hvilket indikerer, at disse neuroner ikke degenererede under aldring (Supplerende fig. 3d). Vi viste således, at DA-niveauer i fluehjernen gradvist faldt med stigende alder, herunder i PPL2ab-neuroner. Navnlig, i det mindste i PPL2ab-klyngerne, var dette ikke resultatet af aldersrelateret neuronal degeneration i den 40-dage gamle fluehjerne.

For at undersøge effekten af ​​øgede DA-niveauer i ældre fluer på frieri, fodrede vi 35 dage gamle hanfluer med L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA; forløberen for DA-syntese) i 5 dage og testede frieri opretholdelse på dag 40. Interessant nok, frieri opretholdelse i fluer, der blev fodret L-DOPA var signifikant opreguleret på en dosisafhængig måde sammenlignet med kontrollen (to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple-sammenligningstest, P<0.05). Tilsvarende blev frieriets indeks og længden af ​​frierikampen væsentligt øget i filer, der blev fodret L-DOPA (to-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en Bonferroni multiple-comparisons test, P<0.05) (Fig. 3a, b). For at udføre en neuronspecifik analyse af virkningerne af øget DA-ekspression inducerede vi ekstra TH-produktion og dermed mere DA-syntese i DAergiske neuroner hos 35 dage gamle hanner ved at fodre lægemiddelfølsomme mutantfluer konstrueret med LexPR/LexAop genekspressionsteknik²¹ (UAS-LexPR;TH-Gal4>LexAop-TH) (Fig. 3c) 1.5 mM RU486 i 5 dage. Vi fandt ud af, at frieriindekset og længden af ​​frierikampen for 40 dage gamle hanner var signifikant øget hos lægemiddelbehandlede fluer (Fig. 3d, e). I modsætning hertil, da vi hæmmede DA-funktionen ved at fodre modne fluer med α-methyl-p-tyrosin (AMPT) eller 3-iod-tyrosin (3IY) (begge potente hæmmere af TH) og reserpin (Res; en hæmmer af vesikulær monoamintransporter) i 5 dage, observerede vi en markant reduktion i frieriindekset og længden af ​​frieri (to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple-sammenligningstest, P<0.05) (Fig. 3f,g ). Hos fluer, der huser det samme genskiftesystem, forstyrrede vi DA-produktion i unge fluer ved RNAi-medieret knockdown af th transgen i DAerge neuroner (UAS-LexPR;TH-Gal4>LexAop-thRNAi) (Fig. 3h), og dette fænokopierede virkningerne af DA-hæmmeradministration (to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple-sammenligningstest, P<0.05) (Fig. 3i,j). Tilsammen indikerer disse data, at DA frigivelse fra TH-Gal4-positive neuroner er nødvendige og tilstrækkelige til at fremme stærk mandlig frieri-adfærd.

PPL2ab-neuroner modulerer mandlig seksualitet hos gamle fluer

Vi spekulerede på, om den formindskede frieriopretholdelse hos gamle hanfluer kunne genoprettes ved at øge DA-niveauerne i PPL2ab-neuroner. Vi inducerede temporært DA-ekspression i PPL2ab-neuroner fra dag 35 til 40 efter eclosion og testede frieri i de 40 dage gamle fluer (Fig. 4a), fandt vi ud af, at frieriindekset og længden af ​​frierikampen var signifikant øget hos ældre mænd (to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple-sammenligningstest, P<0.05) (Fig. 4b, c). I modsætning hertil, da vi inducerede nedregulerede DA-niveauer i PPL2ab-neuroner fra dag 5 til 10 efter eclosion og testede frieri i 10 dage gamle fluer (Fig. 4d), observerede vi et signifikant fald i både frieriindekset og længden af ​​frierikampen hos modne mænd (to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple-sammenligningstest, P<0.05) (Fig. 4e, f). Der var en ikke-signifikant tendens til aftagende frieri-længde mod den halshuggede målhun hos fluer med nedregulerede th i LG121 neuroner versus kontrolgruppen (to-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple-sammenligningstest, P> 0.05).

For yderligere at bekræfte, at ovenstående resultater fuldt ud kunne forklares af DA-signalering, udførte vi adskillige kontrol- og neuronaktivitetsassays. Effektiviteten af ​​alle TH-effektorer brugt i denne undersøgelse blev bekræftet af RT-qPCR og TH-immunfarvningsmetoder, og i hvert tilfælde observerede vi en signifikant ændret mængde af th transkript og TH-protein i fluer (Supplerende Fig. 4). Derudover brugte vi ReaChR (rød-aktiverbar ChR)^22,23 at modulere aktiviteten af ​​PPL2ab-neuroner ved fluorescerende rødt lys-luminescens under fluefrieri-assays. Frieriets opretholdelse var signifikant øget i eksperimentelle grupper med lysaktiverede PPL2ab-neuroner sammenlignet med kontrollerne, i overensstemmelse med vores resultater opnået ved direkte at øge DA-niveauer (envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys test, P<0.05) (Supplerende Fig. 5). Desuden observerede vi et signifikant øget frieriindeks og længde af frierikampe hos både intakte kvinder og afhuggede kvindelige mål.

To par PPL2ab-neuroner påvirker seksualitet hos ældre mænd

I betragtning af at ekspressionsmønstrene for de fire PPL2ab-drivere, vi brugte i denne undersøgelse, er ret brede og i betragtning af tidligere resultater, der antyder, at PPL2ab-neuroner fungerer i reguleringen af ​​mandlig seksuel opretholdelse, var beviserne fra eksperimenterne til dette punkt kun korrelative. Derfor brugte vi en intersektionel genetisk strategi til præcist at manipulere DA-niveauer af PPL2ab-neuroner for at etablere årsag-og-virkning-forhold mellem DA-niveauerne af PPL2ab-neuroner og frieri-adfærd hos hanfluer. Specifikt anvendte vi en LexA-induceret FLP/frt rekombinationsmetode, der var optimeret til at inducere målrettet TH-fejludtryk i en intersektionel region defineret af overlappende GAL4- og FLPase-aktiviteter (Fig. 5a). Denne strategi fungerer som følger: FLPase drevet af LexA fjerner enten frt-stop-frt (>>>) fra UAS-frt-stop-frt-mCD8::GFP (UAS>*> GFP) eller den frt-stop-frt (>>>) fra UAS-frt-stop-frt-TH (UAS>*>TH) i LG121udtrykker neuroner (Fig. 5b). Derefter, UAS-mCD8::GFP aktiveres kun af GAL4 i PPL2ab-neuroner, der er placeret i de regioner, som begge er målrettet mod LG121-LexA , murashka-1-Gal4 (LG121∩murashka-1) (Fig. 5c). Vi brugte derefter disse fluer til yderligere adfærdsundersøgelser. Efter at have anvendt intersektionel målretning til specifikke PPL2ab-neuroner fandt vi kun to par TH-positive PPL2ab-neuroner, der var mærket af UAS-mCD8::GFP. Overekspression af TH i disse to par af PPL2ab-neuroner forbedrede frieriindekset og længden af ​​frierikamp hos 40 dage gamle mænd (en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukeys test, P<0.05) (Fig. 5d, e). Disse resultater identificerede den undergruppe af PPL2ab-neuroner, der er nødvendige og tilstrækkelige til DA-medieret frieri.

Ud over at spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​seksualitet^6,8DA regulerer også andre væsentlige fysiologiske funktioner i mange organismer, herunder bevægelse¹, belønningsrelaterede svar³, erkendelse^2,5, opmærksomhed⁵, døgnrytme ⁴, motivation^2,3, indlæring og hukommelse²⁴. Tidligere forskning har bekræftet, at DA bidrager til mange funktioner hos fluer^{18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. I denne undersøgelse satte vi os for at bestemme det neurale kredsløb, der ligger til grund for DA-regulering af frieri gennem genetiske og farmakologiske manipulationer kombineret med adfærdsassays.

Frieriindekset er et kvantitativt udtryk for frierivarighed målt som procentdelen af ​​tid brugt på frieriadfærd i hver forsøgsperiode. Derfor kvantificerer det den relative mængde af frieri. Længden af ​​frierikampen kvantificerer varigheden af ​​frieriepisoden, hvilket angiver, i hvilken grad frieriperioden var fragmenteret mellem frieri og ikke-frieri. Derfor kan det bruges som en indikation af frierikvalitet. Vores resultater demonstrerede, både kvantitativt og kvalitativt, en forbedring af mandlig frieri, når DA-niveauer blev øget i PPL2ab-neuroner; vi observerede signifikante stigninger i både frieriindekset (kvantitativ forbedring) og længden af ​​frierikampen (kvalitativ forbedring). Da frieriintensitet ikke altid afspejler parringstilbøjelighed, observerede vi konsekvent ingen statistisk signifikante forskelle i parringssuccesrate, når DA-niveauer blev øget i PPL2ab-neuroner hos mænd (Supplerende Fig. 6). I modsætning hertil, da DA-niveauer blev nedreguleret i PPL2ab-neuroner, observerede vi et signifikant fald i frieriindekset og frieri-længden hos mænd, angivet ved en kvantitativ og kvalitativ hæmning af frierivisning. Interessant nok var DA-frigivelse fra en undergruppe af PPL2ab-neuroner tilstrækkelig til at øge den mandlige frieri i ikke kun unge, men også gamle fluer. Desuden viste vi, at DA-associerede fald i PPL2ab-neuroner førte til aldersrelaterede formindskelser i seksualitet hos mænd. Denne undersøgelse fremhæver derfor vigtigheden af ​​DA-niveauer i PPL2ab-neuroner, som har en potentiel rolle i regulering af nye anti-ældningsprocesser relateret til Drosophila mandlig frieriaktivitet.

På trods af nylige undersøgelser, der tyder på, at neurale DA-mangelfulde fluer viser bevægelses- og sensoriske underskud³⁵ændring af DA-niveauer i PPL2ab-neuroner påvirkede ikke motorisk aktivitet og sensoriske input, herunder lugtesansen og smagssansen, eller endda levetiden (envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys test, P> 0.05) (Supplerende Fig. 7). Dette indebærer, at PPL2ab-neuroner kan regulere mandlig seksualitet specifikt.

Vores resultater kan således have afsløret et specifikt seksuelt motivationskredsløb, hvor PPL2ab-neuroner regulerer mandlig seksuel adfærd gennem ukendte downstream-neuroner via DA-signalering. Forholdet mellem disse neuroner til seksuelt dimorfe neuroner, såsom dem, der udtrykker frugtesløse (fru) gener berettiger yderligere undersøgelse, især når man tænker på, at vores data tyder på, at der kan være overlap i projektionerne af Fru-udtrykkende neuroner og de PPL2ab DA-udtrykkende celler, vi identificerede. Fru-udtrykkende neuronale kredsløb er blevet tæt knyttet til Drosophila mandlig frieriadfærd³⁶, og Fru-udtrykkende neuroner er fordelt i sensoriske, centrale og motoriske systemer^{37,38,39,40,41,42}. Et mandligt specifikt frierihæmmende kredsløb begynder i Or67d sensoriske neuroner, der modtager det eksterne mandlige specifikke feromon cis-vaccenylacetat (cVA) fra DA1 projektionsneuroner. Disse celler videregiver derefter information til DC1 interneuroner i LH, som derefter videresender det cVA-inducerede signal til nedadgående DN1-neuroner. Endelig sender DN1-neuroner deres axoner til thoraxganglion, hvilket forårsager mandlig frierihæmning^{43,44,45,46,47}. Det er værd at bemærke, at alle neuroner i dette kredsløb er fru-positive. Derudover indeholder den mandlige P1-klynge også Fru-positive neuroner, som er potente aktivatorer af mandlig frieri-adfærd⁴⁸. Arbours af P1-neuroner kan forbindes med P2b-interneuroner i den midterste øvre protocerebrum og udvide nedadgående fibre til thoraxganglierne for generering af frierimønster^48,49. I denne undersøgelse fandt vi, at begge PPL2ab-undertyperne identificeret i murashka-1 flip-out kloner arboriserede på samme måde deres neuritter til LH, og en af ​​undertyperne projicerede fibre til den medium superior protocerebrum, også (Fig. 2g, h). På grundlag af disse observationer er det muligt, at PPL2ab-neuroner interagerer med FruM-kredsløbet. Der er dog to andre observationer, der tyder på, at PPL2ab-kredsløbet kan modulere ændringer i frieriaktivitet uafhængigt af FruM-neuroner. For det første blev TH-positive PPL2ab-neuroner ikke målrettet af fru-Gal4 (Supplerende Fig. 8a). For det andet aktivering fru-Gal4 neuroner med ReaChR under frieri assays ikke påvirket frieri opretholdelse (en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's test, P> 0.05) (Supplerende fig. 8b, c). Ikke desto mindre er det Fru-udtrykkende kredsløb bredt fordelt i forskellige sensoriske, centrale og motoriske systemer. Der er stadig brug for yderligere arbejde for at løse dette problem. Grundig anatomisk sporing af neurale kredsløb, der stammer fra specifikke PPL2ab-neuroner, kan således kaste lys over mønsteret af kønsspecifik ledning af et neuralt kredsløb i fluehjernen. Ikke desto mindre giver vores undersøgelse ny indsigt i DA-signaleringens roller i reguleringen af ​​mandlig seksuel adfærd i løbet af levetiden, hvilket fremmer indsatsen for at forstå den seksuelle hjerne.

Fluestammer

Fluestammer blev opdrættet på standard majsmelsfoder og opbevaret ved 25 °C og 70 % relativ luftfugtighed i en 12:12 timers lys:mørke-cyklus. Den anvendte vildtype-stamme var Canton-S w(CS10). De anvendte GAL4- og LexA-driverstammer var TH-Gal4 (Ref. 17), murashka-1-Gal4 (Ref. 50), c061-Gal4;MB-Gal80 (ref 27, 51), NP2758-Gal4 (ref 34, 51), NP1528-Gal4 (Ref. 27), MB-Gal80;krasavietz-Gal4 (Ref. 51), NP5272-Gal4 (Ref. 27), HL9-62-1N-Gal4, LG121-LexA (en gave fra Ann-Shyn Chiang, NTHU, Taiwan), TH-C1-Gal4 (Ref. 18), TH-D1-Gal4 (Ref. 18) (gave fra Mark Wu, Johns Hopkins University), NP3024-Gal4 , NP5945-Gal4 (#113066, #105062; købt fra Drosophila Genetic Resource Centre, Kyoto Institute of Technology, Japan), UAS-thRNAi (#108879; købt fra Wien Drosophila Ressourcecenter, Wien, Østrig). Det UAS- og LexAop-effektor stammer anvendt var UAS–TH⁵², UAS-LexPR-attp40²¹, UAS-mCD8::GFP, UAS-ReaChR, LexAop-ReaChR (#5137, #5130, #53748, #53747; købt fra Bloomington Drosophila Stock Center, University of Indiana, IN, USA). Det LexAop-mKO , fru-Gal4 (en gave fra Ann-Shyn Chiang, NTHU, Taiwan) og LexAop-GeneSwitch-attp40 (Ref. 21) blev hentet fra de laboratorier, der genererede dem. Vores laboratorium genererede LexAop-TH-attp2, LexAop-TH-attp40, LexAop-thRNAi-attp2, LexAop-thRNAi-attp40, LexAop-FLP-attp3, UAS-frt-stop-frt-TH-attp40 transgene linjer brugt i denne undersøgelse. Alle hjernebilleder og adfærdsanalyse under anvendelse af transgen ekspression udnyttede afkom opnået fra krydsning af Gal4- eller LexA-fluer krydset til de angivne reporter- eller effektortransgener.

immunhistokemi

Helmonteret immunmærkning af den voksne hjerne blev udført som tidligere beskrevet²¹. Kort sagt blev de dissekerede hjerner fikseret i 4% paraformaldehyd i 0.01 M phosphatpufret saltvand (PBS) efterladt på is i 30 minutter, før dissektionen påbegyndtes. Derefter blev hjernerne overført til penetration/blokerende (P/B) buffer (2% Triton X-100, 0.02% NaN)₃og 10 % normalt gedeserum i PBS) ved stuetemperatur og holdt under vakuum i 1 time. Til immunhistokemisk farvning omfattede de primære antistoffer 1:50 muse 4F3 anti-diske stort antistof (anti-DLG) (Hybridoma Bank, University of Iowa) og 1:1,000 rotte anti-tyrosin hydroxylase antistof (anti-TH, NB300-109, Novus Biologicals) ved stuetemperatur natten over. De sekundære antistoffer omfattede biotin-konjugerede gede-anti-muse-IgG'er (Invitrogen) og biotin-konjugerede gede-anti-kanin-IgG'er (Invitrogen), der blev fortyndet 1:200. Biotin-konjugerede IgG'er blev probet af Alexa Fluor streptavidin 633 (1:1,000 fortynding, Invitrogen). Immunfarvede hjerner blev renset og monteret i Focusclear (CelExplorer Labs, Taiwan) og afbildet med et Zeiss LSM700 Confocal Microscope under en 40 × C-Apochromat vand-immersion objektiv linse.

Enkelt-neuron billeddannelse

Til genetisk FLP-out-mærkning, fluer, der bærer hs-flp;+; muraskha-GAL4/UAS>rCD2,y⁺>mCD8::GFP transgene blev varmechokerede ved 37 °C på 4-dages puppestadiet i 10 min. Hjerneprøver blev inkuberet i en cocktail af primære antistoffer, herunder 1:500 kanin anti-GFP (Molecular Probes) og 1:50 muse 4F3 anti-DLG ved stuetemperatur natten over. Efter vask i PBS med 2% Triton X-100 (PBS-T) tre gange, blev prøverne inkuberet i 1:250 biotinyleret gede-anti-muse- eller kanin-IgG (Molecular Probes) ved stuetemperatur i 1 dag. Derefter blev hjerneprøver vasket og inkuberet i en cocktailopløsning inklusive 1:1,000 gede-anti-kanin Alexa Fluor 488 og 1:1,000 Alexa Fluor 635 streptavidin (Molecular Probes) ved stuetemperatur natten over. Efter omfattende vask i PBS blev hjerneprøverne renset og monteret i Focusclear (CelExplorer Labs, Taiwan) til billeddannelse. Prøvehjernerne blev afbildet under et Zeiss LSM700 konfokalmikroskop med en 40 × C-Apochromat vand-immersion objektiv linse.

Frieri assay

Naive mænd uden forudgående social erfaring blev indsamlet på eclosionsdagen og opbevaret i individuelle reagensglas i en 25 °C inkubator med en 12 timers L/D-cyklus. Hundyr blev opbevaret i grupper (f.eks. 20 hunner pr. hætteglas). Frieri-assays blev udført mellem time 2 og time 6 af lyscyklussen hver dag. Et frierikammer (1.2 cm diameter × 0.8 cm højt) indeholdende et lag gærføde blev samlet i hver celle. Fluer blev udsat for et mildt niveau af CO₂ i 10 minutter for at immobilisere dem. Derefter blev både testhanner og målhun overført (3 dage efter eclosion) til hver celle i kammeret og videooptaget (HDR-SR10 digitalt videokamera, Sony, Japan) i 10 min. Frieriindekset blev bestemt af den procentdel af tid før parringsobservationsperioden, som testerhann brugte på at bejle til målkvinnen (dvs. banke, følge, vingevibrationer og parringsforsøg)^53,54. Den gennemsnitlige frieri-længde (varighed) blev beregnet som den tid, manden brugte på at vise uafbrudt frieri-adfærd.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SigmaPlot-softwareversion 12.0. Alle data blev evalueret via envejs ANOVA efterfulgt af kalkuntest eller tovejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni multiple-sammenligningstest. Middelværdier inden for hvert datasæt efterfulgt af de samme bogstaver er ikke signifikant forskellige på 5 %-niveauet. Alle data blev præsenteret som middel+sem

Yderligere metoder

Detaljer om transgenkonstruktion, negativ gravitaxis-assay, proboscis extension response (PER) assay, undgåelsesassay og kvantitative målinger af DA ved HPLC-ECD er angivet i Supplerende online metoder.