Buscar evidencias de saciedade reprodutiva en Drosophila, machos solteiros que estiveron illados de femias durante 3-6 días foron colocados en frascos alimentarios que contiñan ∼25 femias virxes e examináronse por comportamentos de apareamento (cortexo ou copulación) cada 30 minutos. Inicialmente, os homes pasaban o 80% do seu tempo dedicándose a comportamentos de apareamento (cortexo e cópula), pero a porcentaxe diminuíu gradualmente ata o 10% durante 4 horas (Figuras 1A e S1A, dispoñible en liña). Durante o ensaio, os machos apareáronse unha media de 3.3 ± 0.3 veces cunha duración media de cópula de 24.6 ± 0.4 min que non cambiou con apareamentos repetidos. Usamos o termo saciedade para reflectir a propensión gradualmente diminuíndo a participar en comportamentos de apareamento a medida que avanza o ensaio. Para cuantificar este cambio, calculamos un índice de saciedade: a fracción pola que o comportamento de apareamento se reduce nos últimos 60 min en relación aos primeiros 60 min do ensaio, que é 0.82 ± 0.02 para as moscas de tipo salvaxe (Figuras 1A e 1B; Ver Procedementos experimentais). A saciedade reprodutiva robusta obsérvase tanto a nivel de cortexo (índice de saciedade 0.96 ± 0.02; Figura 1C) como de cópula (índice de saciedade 0.82 ± 0.03; Figura 1D). A diferenza doutros aspectos do comportamento de apareamento dos machos, a saciedade non se ve afectada pola experiencia social previa do macho con outros machos (Dankert et al., 2009,Inagaki et al., 2014,Kim et al., 2012) (Figura S1B).

figura 1Saciedade reprodutiva en Moscas masculinas

A saciedade non é o resultado da habituación á presenza de femias, senón que require cópula. Previr a cópula mediante o uso de mulleres de baixa receptividade (Nakayama et al., 1997) ou homes que presentan defectos físicos nos xenitais externos (Castrillon et al., 1993), deu lugar a altos niveis de cortexo que se mantiveron durante todo o ensaio de saciedade (Figuras 1E e S1D). A redución do comportamento de apareamento observada ao final do ensaio non se alterou ao colocar o macho saciado con femias virxes frescas (Figura 1F), pero recuperouse gradualmente ao longo de 3-4 días se o macho foi eliminado das femias (Figura 1F). ). A redución do desexo de apareamento en machos saciados tamén se viu nos ensaios de cortexo estándar (un macho e unha femia nun ensaio de 15 minutos, utilizados ao longo deste estudo cando se analiza a hiposexualidade; ver Procedementos experimentais) (Figuras 1G e 1H). Cando os machos saciados facían cortexo, pasaban unha proporción comparable do tempo de cortexo realizando vibracións unilaterales das ás ("cantando"), pero o seu cortexo a miúdo era transitorio (figuras 1G e 1I). É improbable que a saciedade sexa unha consecuencia do esgotamento físico, porque a actividade locomotora non se cambiou ao completar o ensaio de saciedade (Figura 1J). Concluímos que, ao igual que os mamíferos (Praia e Xordania, 1956), macho Drosophila exhibir unha saciedade reprodutiva transitoria inducida polo apareamento, un distintivo da motivación sexual.

A saciedade reprodutiva paralela coa diminución da capacidade reprodutiva do sexo masculino despois de aparellos repetidos. Esta potencia reducida é evidente en machos que recentemente completaron o ensaio de saciedade, xa que as súas copulacións posteriores resultan poucas, se as hai, descendentes (Figura 1K) (ver taménCrickmore e Vosshall, 2013,Lefevre e Jonsson, 1962,Linklater et al., 2007). Unha base física desta diminución da fertilidade atópase no bulbo ejaculador do macho, que alberga esperma e fluído seminal maduros (Demerec, 1950). O volume da lámpada diminúe paulatinamente ao longo das coincidencias repetidas, con cinética resaltada polo descenso dos comportamentos de apareamento (Figura 1L). Ao final do ensaio de saciedade, os fluídos reprodutivos están esgotados en boa medida e o lume do bulbo reduciuse substancialmente, unha causa presunta da deterioración da fertilidade dos machos nun estado de saciedade reprodutiva. A plenitude do bulbo recupérase despois do ensaio de saciedade, aínda que só ata o ~ 75% despois de 3 días fóra das femias (Figura 1M).

Dado que a unidade de apareamento rastrexa aproximadamente o volume do bulbo eyaculador, preguntamos se se usa información sobre o volume do bulbo para atraer a execución de comportamentos sexuais. Para permitir a copulación pero evitar o esgotamento dos fluídos reprodutivos do bulbo, realizamos un ensaio de saciedade modificado no que as copulacións finalizaron artificialmente 5 minutos despois do inicio, antes de que os fluídos reprodutivos sexan transferidosCrickmore e Vosshall, 2013,Gilchrist e perdiz, 2000,Tayler et al., 2012). Como era de esperar, o bulbo exaculatorio permanece cheo durante todo este ensaio modificado (Figura 2A). Porén, de forma inesperada, atopamos que as cópulas truncadas provocan a saciedade no mesmo grao que as cópulas normais: o número de apareamentos por macho no ensaio mantívose inalterable cando as cópulas se interromperon aos 5 minutos (Figura 2B), a pesar de que o tempo acumulado pasado na cópula era reducido drasticamente (Figura 2C). A saciedade normal en machos con cópulas truncadas tamén se observa nun ensaio de cortexo (Figura 2D). Despois examinamos as consecuencias de baleirar artificialmente o bulbo exaculatorio sen permitir que o macho copule. A activación termoxenética das neuronas da corazonina (crz) provoca a exaculación repetida, mesmo en ausencia de cópula.Tayler et al., 2012). Bulbos ejaculatorios de machos nos que a canle catione sensible á calor TrpA1 (Hamada et al., 2008) foi dirixido a que as neuronas crz (crz > TrpA1) esgotasen despois da incubación a 30 ° C durante 3 días, pero este tratamento non tivo ningún efecto no comportamento de cortexo (Figura 2E). Ademais, a recuperación do impulso de apareamento despois do ensaio de saciedade non foi obstaculizada ao manter artificialmente o estado baleiro do bulbo exaculatorio (Figura 2E). O descubrimento de que a plenitude do bulbo exaculatorio é totalmente disociable do vigor do cortexo é consistente coa cinética de recuperación atrasada da plenitude do bulbo en comparación co impulso de apareamento (Figura 1M). Xuntos, estes resultados argumentan en contra dun papel directo da acumulación ou esgotamento do esperma e do líquido seminal na instrución do impulso de apareamento. Para preguntar se os órganos reprodutores teñen algún papel na determinación aguda da pulsión de apareamento, eliminamos cirurxicamente o abdome posterior, que contén os órganos reprodutores internos e externos. Esta cirurxía non tivo un efecto prexudicial importante sobre o cortexo en varóns inxenuos e non estimulou o cortexo en varóns saciados (Figura 2F; Película S1). Estes resultados mostran que aínda que o impulso de apareamento está calibrado para reflectir a capacidade reprodutiva, os propios órganos reprodutores non teñen ningunha influencia aguda na resposta do macho á presentación dunha femia virxe. Aínda que a información sensorial dos xenitais pode indicar o inicio da cópula, os axustes resultantes e o mantemento da pulsión de apareamento realízanse no SNC.

Identificar os xenes e as neuronas que controlan o apareamento en macho Drosophila, examinamos máis de 1,500 manipulacións xenéticas (ver Procedementos experimentais) no ensaio de saciedade na procura de animais que mantivesen altos niveis de comportamentos de apareamento despois de repetidas cópulas. O único éxito obtido nesta pantalla foi o resultado da activación termoxenética das neuronas dopaminérxicas. Cando as neuronas dopaminérxicas foron estimuladas ao final do ensaio de saciedade usando tirosina hidroxilasa-Gal4 (TH> TrpA1; TH é un encima necesario para a síntese de dopamina), os machos saciados mostraron un rebote dramático nos comportamentos de apareamento (Figura 3A). O rebote obsérvase tanto na cópula (un 58% de diminución da saciedade) como no nacemento (un 84% de diminución da saciedade) (Figuras S2A e S2B). Este achado é paralelo a traballos anteriores que mostran que as neuronas dopaminérxicas do cordón nervioso ventral (VNC) promoven a motivación do macho para manter episodios individuais de cópula (Crickmore e Vosshall, 2013). Nese estudo, a función dopaminérxica localizouse no VNC debido á capacidade de TshGal80 (que inhibe a actividade de Gal4 na maioría das neuronas VNC) para bloquear os fenotipos mediados por Gal4. En cambio, TshGal80 non ten ningún efecto sobre a reversión da saciedade observada nos machos TH> TrpA1 (figuras 3A, S2A e S2B). Xuntos, estes descubrimentos revelan dous papeis funcional e anatómicamente distintos para a dopamina na promoción do impulso de apareamento nas moscas. O impulso inicial para aparearse está establecido polas neuronas dopaminérxicas do cerebro, e unha vez que se inicia a cópula, as neuronas dopaminérxicas do VNC determinan a persistencia e a duración do apareamento.

Para identificar que neuronas dopaminérxicas cerebrais subxacentes á unidade de apareamento, activamos termogeneticamente catro subconxuntos de neuronas dopaminérxicas empregando liñas Gal4 derivadas de elementos potenciadores do pálido locus, que codifica TH (Liu et al., 2012). A estimulación de calquera dos dous subconxuntos de neuronas TH (TH-C' e TH-D'; Figuras 3B e 3C) deu lugar a unha recuperación parcial da saciedade. Esta reversión da saciedade non é un efecto secundario do aumento da locomoción, xa que estimular calquera poboación non afecta significativamente a actividade basal (Figura S3A). A actividade das neuronas destas poboacións é necesaria para o apareamento, xa que o silenciamento específico do adulto das neuronas TH-C' ou TH-D' coa canle de potasio Kir2.1 diminuíu o cortexo (Figura 3D). A propia dopamina é probablemente o sinal de apareamento, xa que a redución da produción de TH nas neuronas TH-C' ou TH-D' con ARN pálido reduciu drasticamente o cortexo (Figura S4).

Para preguntar se as neuronas dopaminérxicas do aparello aparecen dentro do circuíto Fruitless, introducimos un transxeno Gal80 cuxo patrón de expresión é indirectamente controlado polo CIS-elementos reguladores de infructuosa (consulte a lenda da Figura 3B). A estimulación termoxenética nestas moscas (TH-C'> TrpA1;FruGal80 e TH-D'>TrpA1;FruGal80) non logra revertir a saciedade (Figura 3B), argumentando que as neuronas dopaminérxicas que impulsan o apareamento son infrutuosas. Tanto en TH-C' como en TH-D', FruGal80 bloqueou a actividade de Gal4 nunha única neurona por hemisferio cerebral, e en ambos os casos esta neurona situouse no grupo dopaminérxico PAL (Mao e Davis, 2009) (Figuras 3E e S5) . En adultos, ningunha neurona TH-C' ou TH-D' mancha con anticorpos sen froitos (datos non mostrados), pero en ambas as poboacións, un transxene da recombinase FLP inserido no infructuosa locus (FruFLP) identifica neuronas dopaminérxicas únicas pertencentes ao cluster dopaminérxico PALFigura 3F) (Keleman et al., 2012, Mao e Davis, 2009). Esta neurona chámase aSP4 (Keleman et al., 2012, Yu et al., 2010) e demostrouse que prexudica o comportamento de corte cando se feminiza nos homes (von Philipsborn et al., 2014). TH-F e TH-G non etiquetan neuronas no clúster PAL, incluído aSP4 (Liu et al., 2012). Proxectos aSP4 a varias rexións cerebrais dorsais (von Philipsborn et al., 2014), incluído o anterior do protocerebrum medial superior (SMPa) (Ito et al., 2014) (Figura 3F).

Aínda que a activación de aSP4 é necesaria para revertir a saciedade neste sistema, non parece ser suficiente, como a activación termogenética da VT02857-Gal4, que ten como obxectivo aSP4 (Keleman et al., 2012), non aumentou o comportamento de apareamento en machos saciados (Figura 3G), mesmo cando se usaron dúas copias do Gal4 para aumentar a expresión (datos non mostrados). Isto suxire a existencia doutras neuronas dopaminérxicas que traballan con aSP4 para promover o impulso de apareamento. Polo tanto, analizamos ~ 30 liñas Gal4 que marcaban neuronas dopaminérxicas, buscando liñas que puidesen superar a saciedade cando se activasen xunto con aSP4. Identificamos NP5945-Gal4 (Kuo et al., 2015), que non etiqueta aSP4 e non reverteu a saciedade cando se estimula só, pero si aumenta o comportamento de apareamento dos machos saciados cando se estimula xunto con VT02857 (Figura 3G). Silenciar as neuronas VT02857 ou NP5945 en adultos que usan Kir2.1 diminuíu o comportamento de cortexo (Figura 3H), o que suxire que a actividade combinada destas dúas poboacións neuronais é necesaria para promover a acumulación normal do impulso de apareamento. NP5945 etiqueta as neuronas dopaminérxicas non sen froitos en catro grupos (PPL2ab, PPL2c, PPM2 e PPM3) e ten proxeccións ao SMPa (Figura 3I). Aínda que actualmente non podemos illar as neuronas dentro de NP5945 que promoven a unidade de apareamento xunto con aSP4, os nosos resultados suxiren o SMPa como un lugar para o control dopaminérxico da motivación sexual nos machos.

Como un primeiro paso para identificar os obxectivos neuronais da sinalización de dopamina relevantes para a unidade de apareamento, examinamos o cortexo en animais con mutacións nos catro Drosophila receptores de dopamina. Cando se probou aos 3 días, unha combinación de mutacións en tres dos receptores mostrou niveis normais de cortexo, mentres que unha deleción do cuarto, DopR2 (un receptor semellante ao D1) (Han et al., 1996,Keleman et al., 2012), resultou nun cortexo drasticamente reducido sen afectar á actividade locomotora (Figuras 4A e S3B). Estes datos inicialmente parecían estar en conflito cun estudo anterior que informaba niveis normais de cortexo nestes mesmos mutantes DopR2 no mesmo fondo xenético (Keleman et al., 2012). Un exame máis detallado destes mutantes levounos a unha explicación probable desta discrepancia: descubrimos que o impulso de apareamento dos animais DopR2 aumentou gradualmente durante 10-15 días (Figura 4B), do mesmo xeito que, en menor medida, o impulso de apareamento dos animais salvaxes. tipo machos (Figura S1C). Isto suxire que a medida que o impulso de apareamento aumenta coa idade, os receptores de dopamina adicionais se fan gradualmente capaces de recibir o sinal de impulso de apareamento. DopR2 funciona nas neuronas (en oposición ás células non neuronais) para promover a acumulación oportuna da unidade de apareamento, xa que a caída de DopR2 co controlador elav-Gal4 panneuronal fenocopiou o mutante de eliminación (Figura 4C). Os apareamentos nos que participaron machos mutantes DopR3 de 2 días de idade foron totalmente fértiles (datos non mostrados), polo que o fenotipo de comportamento non é unha consecuencia secundaria da esterilidade.

Dentro do circuíto Fruitless, céntrase moito a atención nun locus composto de neuronas ∼40, chamado P1, que é necesario para o comportamento do apareamento (von Philipsborn et al., 2011). A estimulación dun subconxunto de neuronas P1 (etiquetada pola liña Gal4 R71G01, aquí referida como P1-B en referencia ao laboratorio Baker onde foi caracterizada por primeira vez) demostrou que conduce comportamentos de corte cara a obxectos inanimados en movemento, de tamaño de mosca (Kohatsu y Yamamoto, 2015,Pan et al., 2012). Nas nosas mans, a activación das neuronas P1-B impulsa un comportamento de cortexo robusto incluso cara a pezas de goma estacionarias, se están pintadas de negro (Figura 5A; Película S2). Este fenotipo é distinto da activación de todo o circuíto infrutuoso, que impulsa o cortexo en ausencia dun obxectivo (Figura S6A) e da activación das neuronas dopaminérxicas, que non provoca o cortexo de obxectos inanimados (Figura 5A).

Con base na anatomía e o diagrama de cableado de Fruitless, o laboratorio Dickson suxeriu que a neurona dopamina aSP4 pode conectarse a neuronas P1 (von Philipsborn et al., 2014,Yu et al., 2010). Descubrimos que a activación de neuronas P1-B conduce a un forte cortejo en homes saciados (Figura 5B), así como en machos de 3 días de idade que carecen de DopR2 (Figura 5C). A activación das neuronas P1 evita, polo tanto, o requisito de entrada dopaminérxica dependente do estado, o que indica que están funcionalmente augas abaixo do sinal de condución do apareamento da dopamina.

Son as neuronas P1 os obxectivos directos da sinalización dopaminérxica? Como sinalou o laboratorio Dickson (von Philipsborn et al., 2014,Yu et al., 2010), o coetiquetado de neuronas P1-B e neuronas dopaminérxicas (Figura 5D) mostra a mestura de procesos neuronais entre estas dúas poboacións. Detectamos un forte GRASP (reconstitución de GFP entre socios sinápticos) (Feinberg et al., 2008) entre as dúas poboacións, o que indica sitios potenciais de conectividade sináptica (figuras 5E e S6B). Gran parte do sinal GRASP localizouse no SMPa, unha rexión dirixida pola neurona dopaminérxica aSP4 (figura 3F) así como polas neuronas NP5945 (figura 3I). Cando derrumbamos DopR2 nas neuronas P1, vimos unha profunda redución do comportamento de cortexo que se recuperou coa idade (Figura 5G), fenocopiando o mutante DopR2. Esta é unha forte evidencia de que as neuronas P1 reciben o sinal dopaminérxico de impulso de apareamento.

A liña Gal1 P4-B etiqueta algunhas células fóra do cúmulo P1 sexualmente dimórfico (Pan et al., 2012). Cando se introduce FruGal80, a etiquetaxe P1-B dentro do cluster P1 redúcese moito, pero a expresión fóra do cluster non se ve afectada obviamente (Figura 5F). Derrubar DopR2 nestas neuronas restantes non tivo ningún efecto no comportamento de cortexo (Figura 5H), confirmando que as neuronas P1 positivas sen froitos reciben e interpretan o sinal de dopamina. Para preguntar se as neuronas adicionais reciben o sinal de unidade de apareamento a través de DopR2, bloqueamos a actividade Gal4 nas neuronas P1-B (ver Figura 5Lenda) mentres derruba DopR2 en todas as demais neuronas. O bloqueo do derrumbe de DopR2 pan-neuronal nas neuronas P1-B restableceu o cortexo a niveis normais (Figura 5I), argumentando que o sinal de impulso de apareamento dopaminérxico é recibido exclusivamente por P1.

Os presuntos contactos sinápticos entre neuronas dopaminérxicas e P1 na rexión SMPa leváronnos a supervisar a actividade das neuronas dopaminas nesta zona en machos con diferentes estados reprodutivos. Conducimos o sensor de calcio GCaMP6s (Chen et al., 2013) en neuronas dopaminérxicas e descubriu que os niveis de fluorescencia no SMPa rastrexaban o nivel de saciedade do home. De xeito semellante ao accionamento de apareamento, os niveis de fluorescencia diminuíron gradualmente ao longo do ensaio, ata o punto de reducirse nun 80% despois de 4.5 horas (Figuras 6A e 6B). Tamén semellante ao impulso de apareamento, a actividade dopaminérxica no SMPa recuperouse gradualmente do ensaio de saciedade ao longo de 3 días de illamento das femias (figura 6B). A neurona aSP4 representa gran parte da actividade dopaminérxica no SMPa, xa que FruGal80 bloquea aproximadamente o 65% da fluorescencia en animais inxenuos (Figura 6C). A fluorescencia non cambiou notablemente coa historia de apareamento nunha rexión non relacionada, o lóbulo óptico (Figura 6A) ou nun neuropil veciño, o lóbulo medial do corpo do cogomelo (Figura 6B). Tampouco se observaron cambios na fluorescencia de SMPa na proteína fluorescente tdTomato insensible ao calcio (p> 0.95) ou con inmunotinción de cerebros fixos de TH> GCaMP6s (p> 0.92) (figuras S7A e S7B). O cambio de fluorescencia de GCaMP6 dependente da historia de apareamento no SMPa tamén se detectou usando VT02857-Gal4, que etiqueta aSP4 e algunhas outras neuronas dopaminérxicas (Figura 6D) (Keleman et al., 2012,Yu et al., 2010), así como NP5945-Gal4, que etiqueta as neuronas en catro grupos dopaminérxicos (Figuras 6E e 3I) (Kuo et al., 2015). Estes resultados mostran que a actividade dopaminérxica nas proximidades da conexión coas neuronas P1 serve como correlato neuronal da unidade de apareamento masculino.

A diminución da actividade basal das proxeccións dopaminérxicas no SMPa suxire que estas neuronas poden converterse en menos excitables despois de aparellos repetidos. Para probar esta idea directamente, impulsamos a canle iónica sensible á luz vermella CsChrimson (Hoopfer et al., 2015,Klapoetke et al., 2014) xunto con GCaMP6 en neuronas dopaminérxicas e utilizaron microscopía de dous fotóns para representar transitorios de calcio inducidos de xeito optoxenético no SMPa. En todas as lonxitudes de estimulación, os picos de fluorescencia dopaminérxicos SMPa foron máis baixos nos cerebros saciados que nos cerebros inxenuos ou nos cerebros probados 3 días despois da conclusión do ensaio de saciedade (Figuras 6F e 6G). A cinética de desintegración de fluorescencia non cambiou coa historia de apareamento (Figura 6H). O apareamento diminúe así a excitabilidade e / ou fluxo de calcio das neuronas dopaminérxicas que proxectan SMPa e deixa sen cambios as propiedades de tampón de calcio. Estes cambios de longa duración suxiren un mecanismo molecular que actúe tanto nas entradas das neuronas dopaminas coma nas propias neuronas dopaminas. O ton de dopamina resultante no SMPa serve como correlato neuronal da unidade de apareamento, provocando a activación das neuronas P1 en resposta á estimulación sensorial das mulleres.

Realizáronse ensaios de cortexo e graváronse en vídeo en cámaras de cortexo cilíndricas (10 mm de diámetro e 3 mm de altura) a 23 ° C e humidade ambiente. A non ser que se indique o contrario, unha mosca macho (de 3 a 6 días) emparellouse con aw¹¹¹⁸ mosca femia virxe en cada cámara. O índice de cortexo calificouse manualmente como a fracción de tempo durante a que a mosca macho se dedica a comportamentos de apareamento (cortexo e cópula) dentro de 5 minutos unha vez que a mosca macho comezou a cortejar. Neste artigo, marcamos manualmente os ensaios de cortexo para manter a coherencia coa puntuación de cortexo nos ensaios de saciedade, cuxo ambiente 3D e gran cantidade de animais complican a puntuación automatizada. Un ataque de cortexo marcouse como iniciado cando o macho se orientou cara á femia, comezou a rastrexala e estendeu unilateralmente a súa á para cantarlle. Un combate puntuábase como terminado se o macho non cantaba nos 30 s seguintes ou se afastaba da femia. Se a mosca macho non se corte nos primeiros 15 minutos de cada ensaio, o índice de cortexo foi puntuado como 0. Usando estes criterios, dous experimentadores (MAC e SXZ) deron rutineiramente índices de cortexo case idénticos en ensaios piloto. Aplicáronse os mesmos criterios ao producir os etogramas da Figura 1G, onde o porcentaxe de tempo de cantar durante o cortexo calculouse como tempo_pasado_cantando/tempo_total_pasado_cortando × 100%. En experimentos termoxenéticos, os ensaios de cortexo realizáronse primeiro a 23 °C e despois de novo a maior temperatura. Para experimentos que impliquen tubGal80^ts (Figuras 3D e 3H), as moscas machos trasladáronse a 30 °C despois da eclosión (Figura 3D) ou 1 día despois da formación do pupario (Figura 3H) e mantivéronse alí (illadas das femias) ata xusto antes do ensaio, que tivo lugar aos 23 anos. °C. Para os experimentos que implicaron mutantes DopR2 ou eliminación de RNAi, só se utilizaron machos de 3 días para evitar os efectos de confusión da idade. O DopR2^attp animais previamente foron introducidos nun fondo cantón-S de tipo salvaxe (Keleman et al., 2012), que serviu como control de fondo de tipo salvaxe nos nosos experimentos de comportamento. Para garantir a coherencia de fondo, volvemos a cruzar o mutante no fondo de Canton-S tres veces máis, sen ningún efecto sobre o cortejo. Polo tanto, combinamos os datos de corte entre antes e despois da segunda introgresión.

Os ensaios de locomoción leváronse a cabo nas cámaras cilíndricas (30 mm de diámetro e 3 mm de altura) a 23 ° C e humidade ambiente. Os machos do Cantón-S (de 3 a 6 días), dos que a metade acababan de realizar o ensaio de saciedade, aspiráronse suavemente cara ás cámaras e permitíronlles explorar as cámaras durante 1 minuto antes de que a súa locomoción fose gravada cunha cámara de vídeo estándar aos 30 anos. fps durante 10 min. A segmentación e seguimento de vídeo leváronse a cabo mediante FIJI (Schindelin et al., 2012) co complemento MTrack2 (http://valelab.ucsf.edu/∼nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

Os cerebros de mosca elimináronse en PBS ou no medio de Schneider (ThermoFisher, 21720-024) e fixáronse inmediatamente en PBST e paraformaldehído ao 4% a temperatura ambiente durante 20 minutos. Despois de lavarse con PBST tres veces (20 min cada unha), os cerebros incubáronse con anticorpos primarios (diluídos en PBST) a 4 ° C durante 48 horas. Despois dun lavado de PBST (tres veces durante 20 min), os cerebros incubáronse con anticorpos secundarios (diluídos en PBST) a 4 ° C durante 48 horas. Despois de tres lavados PBST máis (20 min cada un), os cerebros montáronse con VectaShield (Vector Labs) en diapositivas de vidro empregando procedementos estándar. As seccións confocais adquiríronse usando un microscopio Olympus Fluoview 1000 ou un microscopio Olympus Fluoview 1200 a intervalos de 3-5 μm e obtivéronse proxeccións máximas de pila de imaxes en FIJI (Schindelin et al., 2012).

Os cerebros de mosca foron diseccionados de machos de 3- a 8 días en solución salina externa (Wilson e Laurent, 2005) e montado, cara abaixo cara abaixo, na base dunha placa de Petri con fondo de vidro (MatTek, P35G-1.5-20-C) que alberga 4 ml de solución salina estática externa. Para estabilizar as mostras, adheríronse lóbulos ópticos ao cubreobxectos con cola UV (Kemxert, KOA 300) solidificados cun punteiro láser de cor vermella de 5 mw (Oxlasers, OX-B005). Para imaxinar o SMPa, adquiríronse de catro a sete seccións confocais que abarcan esta rexión usando un microscopio Olympus Fluoview 1000 a intervalos de 3 μm e obtivéronse proxeccións máximas de pilas de imaxes en FIJI (Schindelin et al., 2012). Despois de que un de nós (SXZ) tomou as imaxes, outro de nós (DR, cego ao tratamento) seleccionou rexións de interese (ROI) de SMPa ipsilateral, lóbulo medial do corpo de cogomelo e fondo (preto do lóbulo antenal, onde se proxectan dopamina). sparse) usando a canle tdTomato (Figuras 6B, 6D e 6E) ou a canle GCaMP6s (Figura 6C). Os tamaños do ROI mantivéronse aproximadamente iguais entre as mostras. A fluorescencia media de píxeles en cada ROI calculouse cun programa personalizado MATLAB (Mathworks). A fluorescencia normalizada calculouse como (GCaMP6s_SMPa - GcaMP6s_background)/(tdTomato_SMPa - tdTomato_background). Tamén se utilizou a mesma fórmula para o lóbulo medial do corpo do cogomelo. O programa está dispoñible baixo solicitude.

Microscopía de dixitalización por láser de dous fotóns realizouse mediante un microscopio personalizado como se describiu anteriormente (Carter e Sabatini, 2004). Pouco despois da eclosión, as moscas transferíronse a frascos que contiñan flocos de pataca rehidratados (Carolina Biological Supply, 173200) e 100 μL de solución stock trans-retiniana (Sigma, R2500; 35 mM en etanol). Todos os experimentos realizáronse con moscas adultas dentro de 3-6 días despois da eclosión. Antes da imaxe, os cerebros de mosca disecábanse coidadosamente en condicións de pouca luz e montábanse, cara atrás cara abaixo, nunha placa de Petri revestida (Thermo Scientific, 150318) que contiña 3 ml de solución salina HL3.1 (Feng et al., 2004). GCaMP6s emocionouse a 920 nm e 11.8 mW na mostra e a luz recolleuse en 128 × 128 fotogramas a 256 ms por fotograma. Observouse un nivel basal de activación de CsChrimson dependente da retina a 920 nm (e en todas as lonxitudes de onda probadas entre 860 e 940 nm) que normalmente se atopaban nos primeiros 20 cadros (∼5 s). No marco # 24, un pulso de luz vermella (655 nm) entregouse mediante un LED (Luxeon Star LEDs, LXM3-PD01-0350), que foi accionado por un BuckPuck de 720 mW (Luxdrive, 3021-DE-700), e colimado cunha lente (Carclo, 13193) a ± 3 cm da mostra. Non se recolleron datos de fluorescencia durante a estimulación, co fin de protexer o tubo fotomultiplicador. Para cada serie experimental entregáronse pulsos de luz de diferentes anchos en orde crecente, decrecente ou aleatoria. Os datos de fluorescencia foron analizados en MATLAB mediante un programa semiautomatizado modificado a partir dun algoritmo de análise de compoñentes independente publicado (Mukamel et al., 2009). A vida media de ecay estimouse axustando os datos de desintegración da fluorescencia cunha función exponencial única. Todas as constantes de tempo medidas na Figura 6H son máis longas que as do propio GCaMP6 (<1.2 s en Drosophila) (Chen et al., 2013). O programa está dispoñible a solicitude.