Kynferðisleg löngun karla minnkar venjulega með öldrun. Samt sem áður er skilningur okkar á taugasálfræðilegum grunni fyrir þetta fyrirbæri takmarkaður af þekkingu okkar á heilarásum og taugafrumum sem stjórna kynhvöt karla. Fjöldi rannsókna milli tegunda bendir til þess að dópamín (DA) hafi áhrif á kynhvöt. Hér notum við erfðatæki og atferlisgreiningar til að bera kennsl á skáldsöguhluta DA taugafrumna sem stjórna aldurstengdri tilhugalífi karla Drosophila. Okkur finnst að hækka DA stig í hlutmengi frumna í PPL2ab taugafrumum þyrpingin er nauðsynleg og næg til að auka viðvarandi tilhugalíf hjá bæði ungum og öldruðum karlflugum. Niðurstöður okkar benda til þess að með því að koma í veg fyrir aldurstengda lækkun á DA stigum í PPL2ab taugafrumum létti skert hegðun hegðunar hjá körlum Drosophila. Þessar niðurstöður geta verið grunnurinn að því að hallmæla rafrásirnar sem fylgja kynferðislegri hvatningu hjá körlinum Drosophila heila.

Dópamín (DA) gegna mikilvægu hlutverki í stjórnun hreyfilsins¹, hvatning^2,3, sólarhrings⁴, vitsmuni^2,5 og verðlaun³. Reglugerð um kynferðislega fullnægingu DA hjá spendýrum hefur einnig verið vel lýst^6,7,8. Ennfremur, sönnunargögn um að DA miðli stjórni kynhegðun manna koma frá tilfellum af óviljandi ofnæmi sem stafar af DA meðferð hjá sjúklingum með Parkinsonsveiki⁹. Þrátt fyrir þessar framfarir í skilningi okkar á hlutverki DA í að stjórna kynhvöt hjá spendýrum er taugasérfræðilegur grunnur þessa fyrirbæra á frumu- og hringrásarstigi takmarkaður.

Kynferðisleg aðgerð minnkar venjulega á ellinni^10,11,12. Öldrun einkennist af lífeðlisfræðilegum, meinafræðilegum, atferlislegum og sálfélagslegum breytingum. Allir þessir þættir hafa áhrif á kynlífsstarfsemi og erfitt er að sundra einstökum áhrifum þeirra. Erfðafræðilegt hefur verið að rannsaka frumu- og sameindakerfið sem liggja að baki kynferðislegri hnignun með aldri og er ennþá illa skilið. Framfarir í erfða- og atferlisbúnaði sem hægt er að læra Drosophila, ásamt nánari skilningi á Drosophila tilhugalíf, hafa nú veitt öflugar aðferðir til að kanna nauðsynlegar aðgerðir og reglur um kynhneigð hjá þessum dýrum.

Fyrri rannsóknir með Drosophila sýna fram á að öldrun hefur áhrif á ýmsar lífeðlisfræðilegar aðgerðir, þ.mt hegðun hegðun^13,14,15. Í Drosophila heila, það eru ∼280 DA taugafrumur þar sem frumulíkamar eru skipulagðir í að minnsta kosti 13 þyrpingar¹⁶. Við komumst að þeirri tilgátu að þessar DA taugafrumur innihéldu undirflæði sem stjórna kynhneigð og myndu þannig bjóða upp á öfluga fyrirmynd til að skilja hvernig kynferðisleg viðbrögð karla eru stjórnað af DA leiðum í heila yfir líftíma. Hér erum við að sýna fram á að DA stig í brjóstholsheilbrigði dópamínvirkra þyrpinga taugafrumna 2ab (PPL2ab) stjórna varðhaldi karla og að týrósínhýdroxýlasa (TH), ensím sem ber ábyrgð á myndun DA, stig í þessum frumum lækka með aldri. Athyglisvert er að breyta DA stigum í sértækum PPL2ab taugafrumum hafði ekki áhrif á hreyfivirkni, skynjunarvinnslu (þ.mt lykt og smekk), né lengd lífsins, sem bendir til þess að PPL2ab taugafrumur stjórni kynhneigð karla sérstaklega. Saman benda niðurstöður okkar til taugalífeðlisfræðilegs fyrirkomulags til að minnka kynhneigð við öldrun og auka skilning okkar á því hvernig heilinn stjórnar kynhvöt kyns og kynferðislega hvatningu.

PPL2ab taugafrumur stjórna kynhneigð í karlflugum

Til að ákvarða sérstakar DA taugafrumur sem stjórna DrosophilaViðhald dómstóla notuðum við Gal4 ökumenn til að vinna DA virkni í takmörkuðum hópum DAergic taugafrumna í fluguheilanum (Viðbótarupplýsingar Mynd 1; murashka-1-Gal4 ökumaður inn Mynd 2a; og dregið saman í Viðbótartafla 1). Við greindum síðan frá áhrifum frumutegundar of-tjáningar á DA yfirburði í tilhugalíf hjá karlflugum (Fig. 1). Niðurstöður okkar leiddu í ljós að aukin tjáning TH í TH-Gal4-(tilvísun. 17) Og TH-C1-Gal4-jákvæð¹⁸ taugafrumur juku marktækt karlkyns tilhugalista (Fig. 1). Athyglisvert er að við sáum svipaðar niðurstöður með því að ofreyna TH í murashka-1-Gal4-staðbundnar taugafrumur, sem miða við takmarkaðri frumufjölda (Fig. 1). Að merkja frumurnar sem miðað er við TH-Gal4, TH-C1-Gal4 og murashka-1-Gal4, við fórum yfir hverja línu að UAS-mCD8 :: GFP fréttaritara og teljið hvert með TH ónæmisheilbrigðafræði. Með því að meta líffærafræðilega snið TH-frumna sem sameinuðu GFP í hverri línu, komumst við að því að tjáning skarðist milli þriggja Gal4 ökumanna í undirmagni DA taugafrumna í PPL2ab (Mynd 2a1 og Viðbótar mynd 1g1) og dópamínvirka þéttingar taugafrumum í brjóstholi og hjarta og lungum (PPM1 / 2) (Mynd 2a2 og Viðbótar mynd 1g3). Þessi gögn bentu til þess að styrkleiki karlmennsku gæti verið stjórnaður af DA losun frá þessum taugafrumum.

Til að skýra hvort PPL2ab eða PPM1 / 2 taugafrumur eru þátttakendur í hegðun karlmanna, skoðuðum við áhrif þess að val og yfirtjáning á TH og GFP frá tveimur Gal4 ökumönnum og einum LexA bílstjóra sem gefin eru upp á þessum svæðum. Við fundum það NP3024-Gal4 og NP5945-Gal4 voru að hluta til settar fram í PPL2ab og PPM1 / 2 þyrpingum (Mynd 2b, c), meðan LG121-LexA kom aðeins fram í PPL2ab þyrpingunni (Mynd 2d). Við sáum að frumukroppar PPL2ab taugafrumna merktir af þessum ökumönnum voru staðsettir á hliðarbrún verndarbrautarinnar nálægt sjónloppunum (auðkennd með örvum í Mynd 2a – d), og varpað upp stigandi taugatrefjum að kalkinum (CX) og hliðarhorninu (LH). TH-jákvæðir PPL2ab taugafrumur voru merktir af fjórum sjálfstæðum ökumönnum sem notaðir voru í þessari rannsókn (murashka-1-Gal4, NP5945-Gal4, NP3024-Gal4 og LG121-LexA) (Myndir 2a1 – d1) og mikilvægt er að tjáningarmynstur þessara fjögurra ökumanna skarast aðeins í PPL2ab taugafrumum. Til að ákvarða hvort þessar PPL2ab taugafrumur stjórna hegðun dómstóla, ofreyndum við TH með því að nota hvern bílstjóra og gerðum hegðunarpróf. Við sáum umtalsverða hækkun á dómstólavísitölu og lengd dómstóla gagnvart annaðhvort ósnortnum eða svæfðum (þ.e.a.s. hreyfilömdum konum) miða á konur í öllum línum (einstefna ANOVA fylgt eftir með próf Tukey, P<0.05) (Mynd 2e, f). Notkun svæfðra kvenkyns kvenna veitir aðferð til að meta hvort kynferðislegt aðdráttarafl karlmanna og aukin tilhugalíf dómstóla sé stjórnað af hækkuðu DA stigum í PPL2ab taugafrumum. Með því að nota hreyfanlegur kvenkyns fjarlægðum við gagnkvæm áhrif samskipta karla og kvenna. Niðurstöður okkar sýna því fram á að PPL2ab taugafrumur höfðu sérstaklega áhrif á styrkleika karlmennsku í gegnum DA, frekar en aðdráttarafl þeirra.

Það eru um það bil sex taugafrumur í PPL2ab þyrpingunni í hverju heilahveli, sem í fyrri rannsóknum¹³ hafa verið flokkaðar í að minnsta kosti fjórar undirtegundir byggðar á innri trefjum þeirra. Tvær undirtegundir PPL2ab taugafrumna vinna að ípsilateral CX og LH; annar leggst inn í allan LH, en hinn innvostur aðeins legghlutann. Önnur undirgerð bætir lobula og teygir dorso-miðla grein sem liggur meðfram aftari sjónarsporinu (POT) og rambar nær borsenda vélinda. Eftirgerðartegundin leggst inn á bakhlið hliðarverndar¹³. Meðal PPL2ab bílstjóralínanna sem við notuðum voru þrjár (NP3024-Gal4, NP5945-Gal4 og LG121-LexA) sýndu sérstök POT-tjáningarmynstur (auðkennd með örhausum í Mynd 2b – d), meðan murashka-1-Gal4 kom ekki fram í POT. Þetta gaf í skyn að innöndun PPL2ab í POT gæti verið ráðstafanleg til að stjórna styrkleika karlmennsku.

Til að staðfesta hvaða aðrar undirtegundir PPL2ab taugafrumna eru líklega nauðsynlegar til að halda uppi karlmennsku, er murashka-1-Gal4 lína var notuð til að keyra UAS>CD2, y⁺> CD8 :: GFP transgen ásamt an Hs-flp transgen. Tvær mismunandi undirgerðir PPL2ab taugafrumna í murashka-1-Gal4 voru afkóðaðir í flip-out klónum (Mynd 2g, h). Ein af einræktunum innihélt frumur með hækkandi taugafrumum sem tauguðu CX, og önnur grein taugafrumna sem stíflaði allt LH og yfirburði miðlæga verndarbólga (Mynd 2g; Viðbótar kvikmynd 1). Önnur klón frumna spáði einum grein frumtaugafrumna að CX og annarri grein að aðliggjandi aftari óæðri hliðarverndarfrumu og miðhluta LH; þriðja útibúið varpað miðlæglega út og innraðu miðju óæðri miðjuverndarfrumu (Mynd 2h; Viðbótar kvikmynd 2). Þegar þau voru skoðuð í tengslum við hegðunarárangur okkar bentu þessi líffræðilegu tjáningargögn til þess að hækkun DA stiganna vakti í undirmengi murashka-1-Gal4 að tjá PPL2ab taugafrumur á þessum svæðum tengdist tilhneigingu dómstóla hjá ungum fullorðnum flugum (10 daga gamlar).

DA stig hafa áhrif á endingu dómstóla hjá öldruðum flugum

Seðlabanki er fyrirbæri sem felur í sér lækkun á lífeðlisfræðilegum aðgerðum með tímanum vegna skaðlegra aukaverkana stöðugra efnaskiptaviðbragða í lifandi líkama. Greint hefur verið frá því að öldrun hafi áhrif á kynhneigð og kynhvöt¹⁰. Til að ákvarða hvort tilhöfðun dómstóla breytist sem Drosophila aldur, greindum við hegðun hegðun hjá villtum tegundum S-menn (CS) karlmenn á mismunandi aldri (5–60 daga) og komumst að því að hámarks dómstólavísitala og lengd dómstóla var á 10 daga aldri hjá fullorðnum körlum (Viðbótar mynd 2a, b). Niðurstöðurnar leiddu einnig í ljós að aukning dómsmáls minnkaði smám saman við öldrun frá hámarki við 10 daga aldur. Í ljósi þess að hreyfivirkni og tilhugalífstarfsemi eru nátengd skoðuðum við næst hreyfifærni í tengslum við aldur í flugum. Neikvæð þyngdaraflsgreining (klifurgreining)¹⁹sýnt fram á að klifurvirkni er viðvarandi flestan líftíma áður en hann minnkaði í 50 daga gömlum flugum ()Viðbótar mynd 2c). Við nýttum Drosophila kerfið fyrir eftirlits með virkni²⁰ að skrá ósjálfráða hreyfivirkni 10- og 40 daga karlmanna í 24 klukkustundir og sýndi fram á að enginn marktækur munur sást á milli hópanna tveggja (Viðbótar mynd. 2d). Hins vegar sást meira en tífalt lækkun DA stigs í vefjasýnum á höfðum 10 daga gamalla karla, samanborið við 40 daga gamla þroska karla (Viðbótar mynd 3a, b). Við staðfestum síðan með TH ónæmisinnihaldi að TH próteinmagn var lækkað í PPL2ab taugafrumum hjá öldruðum körlum (Viðbótar mynd 3c). Að auki var fjöldi PPL2ab taugafrumna sá sami í aldrinum flugum sem bentu til þess að þessar taugafrumur hrörnuðu ekki við öldrun (Viðbótar mynd. 3d). Við sýndu þannig fram á að DA stig í fluguheilanum lækkuðu smám saman með hækkandi aldri, meðal annars í PPL2ab taugafrumum. Einkum og sér í lagi, að minnsta kosti í PPL2ab þyrpingum, var þetta ekki afleiðing aldurstengdrar taugasjúkdómsrýrnunar í 40 daga gömlum fluguheilanum.

Til að kanna áhrif hækkaðs DA stigs á aldrinum flugum á tilhneigingu til dómstóla fórum við 35 daga gamlar karlflugur með L-3,4-díhýdroxýfenýlalanín (L-DOPA; undanfari DA myndunar) í 5 daga og prófað viðhald á tilhugalífinu á degi 40. Athyglisvert er að framhaldsstörf í flugum sem fengust L-DOPA var verulega uppstýrt á skammtaháðan hátt, samanborið við samanburðarhópinn (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Bonferroni margsamanburðarprófi, P<0.05). Samsvarandi var tilhugalífsvísitalan og lengd lotningartímabils aukin verulega í skrám sem voru gefnar L-DOPA (tvíhliða greining á dreifni (ANOVA) og síðan Bonferroni margfeldis samanburðarpróf, P<0.05) (Mynd 3a, b). Til að framkvæma taugasértæka prófun á áhrifum aukinnar DA-tjáningar, framkölluðum við aukna TH framleiðslu og þar með meiri DA myndun, innan DAergic taugafrumna í 35 daga gömlum körlum með því að fóðra lyfjaviðkvæmum stökkbreyttum flugum sem hannaðar voru með LexPR/LexAop genatjáningartækni²¹ (UAS-LexPR; TH-Gal4>LexAop-TH) (Mynd 3c) 1.5 mM RU486 í 5 daga. Við komumst að því að tilhlutun vísitölu og tilhneigingu lengd 40 daga gamalla karla var marktækt aukin í flugum sem meðhöndlaðar voru með lyfjum (Mynd 3d, e). Aftur á móti þegar við hindruðum DA virkni með því að fóðra þroskaðar flugur með α-metýl-p-týrósín (AMPT) eða 3-joð-týrósín (3IY) (báðir öflugir hemlar á TH) og reserpín (Res; hemill á vesikulum mónóamín flutningafyrirtæki) í 5 daga, við sáum umtalsverða lækkun á dómstólavísitölu og lengd dómstóla (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Bonferroni margvíslegum samanburðarprófi, P<0.05) (Mynd 3f, g ). Í flugum sem hafa sama genaskiptakerfið, trufluðum við framleiðslu DA í ungum flugum með RNAi-miðluðu rothöggi af th transgen í DAergic taugafrumum (UAS-LexPR; TH-Gal4>LexAop-thRNAi) (Mynd 3h), og þetta fenocopied áhrif DA gjöf hemla (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Bonferroni margfeldi-samanburðarprófi, P<0.05) (Mynd 3i, j). Saman benda þessi gögn til þess að DA sleppi frá TH-Gal4-Skiljanlegar taugafrumur eru nauðsynlegar og nægar til að stuðla að sterkri hegðun karla.

PPL2ab taugafrumur móta kynhneigð karlmanna á aldrinum flugum

Við veltum því fyrir okkur hvort hægt væri að endurheimta minnkaða tilhugalíf dómstóla í aldrinum karlflugum með því að hækka DA stig í PPL2ab taugafrumum. Við örvuðum DA-tjáningu tímabundið í PPL2ab taugafrumum frá 35 til 40 eftir post-eclosion og prófuðum viðhald dómstóla í 40 daga gömlum flugunum (Mynd 4a), komumst við að því að dómstólavísitala og lengd dómstóla var aukin verulega hjá öldruðum körlum (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Bonferroni margfeldi-samanburðarprófi, P<0.05) (Mynd 4b, c). Aftur á móti, þegar við framkölluðum stjórnun DA stigs í PPL2ab taugafrumum frá degi 5 til 10 eftir fóstureyðingu og prófuðum viðhald dómstóla í 10 daga gömlum flugum (Mynd 4d), við sáum verulega lækkun bæði á dómstólavísitölu og lengd dómstóla hjá þroskuðum körlum (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Bonferroni samanburðarprófi, P<0.05) (Mynd 4e, f). Það var ekki marktæk tilhneiging til að lækka lengd dómstóla gagnvart höfðingja kvenkyns kvenna í flugum með undirreglu th í LG121 taugafrumum samanborið við samanburðarhópinn (tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Bonferroni margfeldi-samanburðarprófi, P> 0.05).

Til að staðfesta enn frekar að hægt væri að skýra framangreindar niðurstöður að fullu með DA-merki, gerðum við nokkrar samanburðar- og taugafrumumælingar. Árangur allra TH áhrifa sem notaðir voru í þessari rannsókn var staðfestur með RT-qPCR og TH ónæmisþéttandi aðferðum og í hverju tilviki sáum við verulega breytt magn af th uppskrift og TH prótein í flugum (Viðbótarupplýsingar Mynd 4). Að auki notuðum við ReaChR (rauðvirkjandi ChR)^22,23 að móta virkni PPL2ab taugafrumna með flúrljómandi rauðu ljósi ljósgeislun meðan á prófunum á flugdómi stendur. Uppbygging dómsmáls var aukin verulega í tilraunahópum með ljósvirkar PPL2ab taugafrumur samanborið við viðmið, í samræmi við niðurstöður okkar sem fengust með því að hækka DA stigum beint (einstefna ANOVA fylgt eftir með próf Tukey, P<0.05) (Viðbótarupplýsingar Mynd 5). Ennfremur sáum við verulega aukna dómstólavísitölu og lengd dómstóla hjá báðum ósnortnum konum og höfðingjum kvenkyns markmiðum.

Tvö pör af PPL2ab taugafrumum hafa áhrif á kynhneigð hjá öldruðum körlum

Í ljósi þess að tjáningarmynstur fjögurra PPL2ab ökumanna sem við notuðum í þessari rannsókn eru nokkuð víðtæk og með hliðsjón af fyrri niðurstöðum sem bentu til þess að PPL2ab taugafrumur virki við stjórnun kynferðislegrar kynferðis karlmanna, voru sönnunargögnin sem tilraunirnar veittu að þessu marki einungis fylgni. Þess vegna notuðum við skurðlæga erfðafræðilega stefnu til að meðhöndla nákvæmlega DA stig PPL2ab taugafrumna til að koma á orsök og afleiðing sambönd milli DA stigum PPL2ab taugafrumna og tilhugalífsatferða hjá karlflugum. Sérstaklega notuðum við FLP af völdum LexA/ frt endurröðunaraðferð sem var gerð til að framkalla markvissa TH misexpression á gatnamótum sem skilgreind voru með skörun GAL4 og FLPase starfsemi (Mynd 5a). Þessi stefna virkar sem hér segir: FLPase sem er rekinn af LexA fjarlægir annað hvort frt-stopp-frt (> *>) frá UAS-frt-stöðva-frt-mCD8 :: GFP (UAS> *> GFP) eða frt-stopp-frt (> *>) frá UAS-frt-stöðva-frt-TH (UAS> *> TH) í LG121tjá taugafrumur (Mynd 5b). Þá, UAS-mCD8 :: GFP er aðeins virkjað af GAL4 í PPL2ab taugafrumum sem eru staðsettir á svæðunum sem báðir miða að LG121-LexA og murashka-1-Gal4 (LG121∩murashka-1) (Mynd 5c). Við notuðum síðan þessar flugur til frekari atferlisrannsókna. Eftir að hafa beitt miðlægum miðun á sérstakar PPL2ab taugafrumur fundum við aðeins tvö pör af TH-jákvæðum PPL2ab taugafrumum með því að vera merkt með UAS-mCD8 :: GFP. Ofþróun TH í þessum tveimur pörum af PPL2ab taugafrumum jók dómstólavísitölu og lengd dómstóla hjá 40 daga gömlum körlum (einstefna ANOVA og síðan próf Tukey, P<0.05) (Mynd 5d, e). Þessar niðurstöður bentu á hlutmengi PPL2ab taugafrumna sem eru nauðsynleg og nægjanleg fyrir DA-miðlað tilhugalíf.

Auk þess að gegna mikilvægu hlutverki í reglugerð um kynhneigð^6,8, DA stjórnar einnig öðrum nauðsynlegum lífeðlisfræðilegum aðgerðum í mörgum lífverum, þar með talið hreyfingu¹, svör við laununum³, vitsmuni^2,5, athygli⁵, circadian taktar ⁴, hvatning^2,3, nám og minni²⁴. Fyrri rannsóknir hafa staðfest að DA stuðlar að mörgum aðgerðum í flugum^{18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. Í þessari rannsókn settum við fram til að ákvarða taugrásirnar sem liggja að baki DA reglugerð um tilhugalíf með erfðafræðilegum og lyfjafræðilegum aðferðum ásamt hegðunarprófum.

Dómstólsvísitalan er megindleg tjáning tímalengdar tilhugalífs, mæld sem hlutfall af tíma sem varið er í hegðun dómstóla á hverju tilraunatímabili. Þess vegna magngreinir það hlutfallslegt magn dómstóla. Lengd dómstóla er lengd tímalengdar tilhugalífs fyrir dómstóla, sem gefur til kynna að hve miklu leyti tilhugalífið var sundurliðað milli tilhugalífs og hegðunar utan dómstóla. Þess vegna er hægt að nota það sem vísbendingu um gæði dómstóla. Niðurstöður okkar sýndu, bæði megindlega og eðlisfræðilega, aukningu á birtingarmynd karlmanna þegar DA stig voru hækkuð í PPL2ab taugafrumum; við sáum verulegar hækkanir bæði á tilhugalífstölunni (magnbundinni aukahluti) og lengd dómstóla (eigindleg aukning). Þar sem styrkleiki dómstóla endurspeglar ekki alltaf tilhneigingu við pörun, sáum við stöðugt engan tölfræðilega marktækan mun á árangri við pörun þegar DA stig voru hækkuð í PPL2ab taugafrumum hjá körlum (Viðbótarupplýsingar Mynd 6). Aftur á móti, þegar DA stigum var lækkað í PPL2ab taugafrumum, sáum við verulega lækkun á dómstólavísitölu og lengd dómstóla hjá körlum, táknuð með megindlegri og eigindlegri hömlun á tilhugalífinu. Athyglisvert er að losun DA úr hlutmengi af PPL2ab taugafrumum dugði til að auka karlkyns tilhugalíf hjá ekki aðeins ungum, heldur einnig á aldrinum flugum. Ennfremur sýndum við að DA-tengd lækkun í PPL2ab taugafrumum leiddi til aldurstengdra skerðinga á kynhneigð hjá körlum. Þessi rannsókn dregur því fram mikilvægi DA stigs í PPL2ab taugafrumum, sem hafa mögulegt hlutverk í að stjórna nýjum ferli gegn öldrunartíðni sem tengjast Drosophila tilhugalíf karla.

Þrátt fyrir nýlegar rannsóknir sem benda til þess að flugur með DA-skort í taugum sýni hreyfingu og skynjunarskort³⁵að breyta DA stigum í PPL2ab taugafrumum hafði ekki áhrif á hreyfiafl og skynsemi, þar með talið lyktarskyn og smekk, eða jafnvel líftíma (aðra leið ANOVA fylgt eftir með próf Tukey, P> 0.05) (Viðbótarupplýsingar Mynd 7). Þetta felur í sér að PPL2ab taugafrumur gætu stjórnað kynhneigð karla sérstaklega.

Niðurstöður okkar gætu því hafa leitt í ljós sérstaka kynferðislega hvatningarrás þar sem PPL2ab taugafrumur stjórna kynferðislegri hegðun karla með óþekktum taugafrumum fyrir aftan veg með DA merki. Samband þessara taugafrumna við kynferðislega dimorf taugafrumur eins og þær sem tjá sig ávaxtalaus (Fru) gen tilefni til frekari rannsókna, sérstaklega þegar haft er í huga að gögn okkar benda til þess að það geti verið skörun í áætlun um fru-tjáandi taugafrumur og PPL2ab DA-tjáningarfrumur sem við greindum. Ávaxtatjáning taugakerfi hefur verið nátengt Drosophila hegðun karla³⁶, og Fru-tjáandi taugafrumur dreifast í skynjunar-, mið- og mótorkerfi^{37,38,39,40,41,42}. Hömlunarbraut karlmanns ákveðin tilhugalíf hefst í Or67d skyntaugafrumum sem fá ytri karl-sértæka ferómón cis-vaccenyl asetat (cVA) frá DA1 vörpun taugafrumum. Þessar frumur gefa síðan upplýsingar til DC1 innriuróna í LH sem síðan miðlar cVA völdum merki til lækkandi DN1 taugafrumna. Að lokum senda DN1 taugafrumur axon sína til brjóstholsins í brjóstholi, sem veldur hömlun karlkyns dómstóla^{43,44,45,46,47}. Þess má geta að allar taugafrumur í þessum hringrásum eru Fru-jákvæðar. Að auki inniheldur karl-sértæki P1 þyrpingin einnig Fru-jákvæðar taugafrumur, sem eru öflugir virkjendur á hegðun karlmennsku⁴⁸. Arbours af P1 taugafrumum getur tengst P2b interneurons í miðju yfirburði protocerebrum og lengt niður trefjar til brjósthola í brjóstum til að mynda tilhugalífsmynstur^48,49. Í þessari rannsókn fundum við að báðar PPL2ab undirtegundirnar sem greindar voru í murashka-1 flip út klón á svipaðan hátt arborised taugafrumur sínar og LH og ein af undirtegundum varpað trefjum að miðlungs yfirburði protocerebrum, eins og heilbrigður (Mynd 2g, h). Á grundvelli þessara athugana er mögulegt að PPL2ab taugafrumur hafi samskipti við FruM hringrásina. Hins vegar eru tvær aðrar athuganir sem benda til þess að PPL2ab rafrásirnar geti breytt breytingum á virkni dómstóla óháð FruM taugafrumum. Í fyrsta lagi var ekki miðað við TH-jákvæðu PPL2ab taugafrumurnar fru-Gal4 (Viðbótar mynd 8a). Í öðru lagi að virkja fru-Gal4 taugafrumur með ReaChR meðan á dómsmatsrannsóknum stóð höfðu ekki áhrif á viðhald dómstóla (aðra leið ANOVA og síðan próf Tukey, P> 0.05) (Viðbótar mynd 8b, c). Engu að síður dreifir Fru-tjáningarkerfi í stórum dráttum í mismunandi skynjunar-, mið- og mótorkerfi. Enn er þörf á frekari vinnu til að leysa þetta mál. Þannig getur ítarleg líffærafræðileg rekja taugarásir sem eru upprunnar frá sértækum PPL2ab taugafrumum varpað ljósi á mynstrið kynbundna raflögn taugakerfis í fluguheilanum. Engu að síður veitir rannsókn okkar nýjar innsýn í hlutverk DA merkja við að stjórna kynferðislegri hegðun karla yfir líftíma, sem stuðlar að viðleitni til að skilja kynheilinn.

Fljúgstofnar

Flugustofnar voru hækkaðir á venjulegum kornmjölsfæðu og hýstir við 25 ° C og 70% rakastig á 12:12 klst. Ljósmyrkri hringrás. Villtur tegund stofnsins sem notaður var var Canton-S w (CS10). GAL4 og LexA bílstjórastofnarnir sem notaðir voru voru TH-Gal4 (tilvísun. 17), murashka-1-Gal4 (tilvísun. 50), c061-Gal4;MB-Gal80 (vísar 27, 51), NP2758-Gal4 (vísar 34, 51), NP1528-Gal4 (tilvísun. 27), MB-Gal80; krasavietz-Gal4 (tilvísun. 51), NP5272-Gal4 (tilvísun. 27), HL9-62-1N-Gal4og LG121-LexA (gjöf frá Ann-Shyn Chiang, NTHU, Taívan), TH-C1-Gal4 (tilvísun. 18), TH-D1-Gal4 (tilvísun. 18) (gjöf frá Mark Wu, Johns Hopkins háskóla), NP3024-Gal4 og NP5945-Gal4 (# 113066, # 105062; keypt af Drosophila Erfðarauðlindamiðstöð, Tæknistofnun Kyoto, Japan), UAS-thRNAi (# 108879; keypt frá Vínarborg Drosophila Auðlindamiðstöðin, Vín, Austurríki). The UAS- og LexAop-virkir stofnar sem notaðir voru voru UAS – TH⁵², UAS-LexPR-attp40²¹, UAS-mCD8::GFP, UAS-ReaChR, LexAop-ReaChR (# 5137, # 5130, # 53748, # 53747; keypt af Bloomington Drosophila Verðbréfamiðstöð, University of Indiana, IN, Bandaríkjunum). The LexAop-mKO og fru-Gal4 (gjöf frá Ann-Shyn Chiang, NTHU, Taívan) og LexAop-GeneSwitch-attp40 (tilvísun. 21) voru fengnar frá rannsóknarstofunum sem bjuggu til þeirra. Rannsóknarstofa okkar myndaði LexAop-TH-attp2, LexAop-TH-attp40, LexAop-thRNAi-attp2, LexAop-thRNAi-attp40, LexAop-FLP-attp3, UAS-frt-stöðva-frt-TH-attp40 erfðabreyttar línur sem notaðar voru í þessari rannsókn. Allar heilamyndir og atferlisgreining með erfðabreyttri tjáningu notuðu afkvæmin sem fengust frá því að fara yfir Gal4 eða LexA flugurnar sem fóru yfir á tilgreindan fréttamann eða effector transgenes.

Immunohistochemistry

Ónæmismerking fullorðinna heila fullorðinna var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst²¹. Í stuttu máli, voru klofnu gámarnir festir í 4% paraformaldehýð í 0.01 M fosfatjafnalausu salti (PBS) sem var skilið eftir á ís í 30 mínútur áður en byrjað var á krufningu. Næst voru gáfur fluttar í skarpskyggni / hindrun (P / B) stuðpúða (2% Triton X-100, 0.02% NaN₃og 10% venjulegt geitasermi í PBS) við stofuhita og haldið í lofttæmi í 1 klst. Að því er varðar ónæmisviðbragðs litun voru aðal mótefnin með 1:50 músum 4F3 andstæðingur-Discs stór mótefni (and-DLG) (Hybridoma Bank, University of Iowa) og 1: 1,000 rottum and-týrósín hýdroxýlasa mótefni (and-TH, NB300-109, Novus Biologs) við stofuhita yfir nótt. Auka mótefnin innihéldu biotin-samtengd geitar gegn músum IgG (Invitrogen) og biotin-conjugated geit and-rabbit IgGs (Invitrogen) sem voru þynnt 1: 200. Biotin-samtengd IgG voru rannsökuð með Alexa Fluor streptavidin 633 (1: 1,000 þynning, Invitrogen). Ónæmisþétt heila voru hreinsuð og fest í Focusclear (CelExplorer Labs, Taívan) og myndlögð með Zeiss LSM700 Confocal smásjá undir 40 × C-Apochromat vatnsdýphreinsun linsu.

Ein-taugafrumumynd

Fyrir erfðafræðilega FLP-merkingu, flugur sem bera hs-flp; +; muraskha-GAL4 / UAS> rCD2, y⁺> mCD8::GFP transgen voru hneyksluð við 37 ° C á 4 daga hvolpastiginu í 10 mínútur. Heilasýni voru rækjuð í kokteil af aðal mótefnum þar á meðal 1: 500 kanína gegn GFP (Molecular Probes) og 1:50 mús 4F3 andstæðingur-DLG við stofuhita yfir nótt. Eftir þvott í PBS með 2% Triton X-100 (PBS-T) þrisvar voru sýnin ræktuð í 1: 250 lítínýleruðu geitar gegn mús eða kanínu IgG (Molecular Probes) við stofuhita í 1 dag. Næst voru heilasýni þvegin og ræktuð í kokteillausn þar á meðal 1: 1,000 geit gegn kanínu Alexa Fluor 488 og 1: 1,000 Alexa Fluor 635 streptavidin (Molecular Probes) við stofuhita yfir nótt. Eftir umfangsmikla þvott í PBS voru heilasýnin hreinsuð og sett í Focusclear (CelExplorer Labs, Taívan) til myndgreiningar. Sýnishornin voru tekin undir Zeiss LSM700 confocal smásjá með 40 × C-Apochromat vatnsdýpkun linsu.

Dómstigsrannsókn

Barnalausum körlum án félagslegrar reynslu af prófun var safnað á útfarardegi og haldið í einstökum prófunarrörum í 25 ° C útungunarvél með 12 klst. L / D hringrás. Markhærðar konur voru geymdar í hópum (til dæmis 20 konur á hverju hettuglasi). Gerðardómsrannsóknir voru gerðar á milli klukkustundar og klukkustundar 2 í ljósrásinni á hverjum degi. Forgarðshólf (6 cm í þvermál × 1.2 cm á hæð) sem innihélt lag germat var sett saman í hverri hólfi. Flugur voru útsettar fyrir vægu stigi CO₂ í 10 mín til að gera þær hreyfanlegar. Næst voru bæði prófunar karlar og kvendýrar fluttar (3 dögum eftir lokun) til hverrar frumu í hólfinu og myndband tekið upp (HDR-SR10 stafræna myndbandavél, Sony, Japan) í 10 mín. Dómstólsvísitalan var ákvörðuð af prósentutímanum fyrir athugunartímabil samhæfingarinnar sem prófari karlinn eyddi eftir því að leita að markkonunni (það er að slá, fylgja, væng titringi og reynt að meðhöndla)^53,54. Meðal lotutímabil lotu (lengd) var reiknað sem sá tími sem karlmaðurinn var að sýna samfleytt hegðun.

tölfræðigreining

Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með SigmaPlot hugbúnaðarútgáfu 12.0. Öll gögn voru metin með annarri leið ANOVA fylgt eftir með kalkúnaprófi eða tvíhliða ANOVA fylgt eftir með Bonferroni margfeldi samanburðarprófi. Flutningur innan hvers gagnasafns og síðan sömu stafir eru ekki marktækt frábrugðnir á 5% stigi. Öll gögn voru kynnt sem meðaltal + sem

Viðbótaraðferðir

Upplýsingar um smíði transgena, neikvæðar greiningar á gravitaxis, prófun á stækkun svörtu (PERoscis Extension) (PER), forðastun og megindlegar mælingar á DA með HPLC-ECD eru að finna í Viðbótaraðferðir á netinu.