PLOS Biology
(2019) 17(4): e2006421 doi:10.1371/jornal.pbio.2006421
Tunstall BJ, Kirson D, Zallar LJ, McConnell SA, Vendruscolo JCM, Ho CP, et al.
Sumário
Foi relatado que a administração de ocitocina diminui o consumo, a abstinência e a busca por drogas associadas a várias drogas de abuso e, portanto, representa uma abordagem farmacológica promissora para o tratamento da dependência de drogas. Usamos um modelo estabelecido de dependência de álcool em ratos para investigar os efeitos da ocitocina no consumo de álcool induzido pela dependência, maior motivação para o álcool e transmissão GABAérgica alterada no núcleo central da amígdala (CeA). A administração intraperitoneal de ocitocina bloqueou o aumento do consumo de álcool e o aumento da motivação para o álcool em ratos dependentes de álcool, mas não não dependentes. A entrega intranasal de ocitocina replicou totalmente esses efeitos. A administração intraperitoneal teve efeitos menores, mas significativos, de redução da locomoção e ingestão de soluções palatáveis não alcoólicas, enquanto a administração de ocitocina intranasal não. Em ratos dependentes, a administração intracerebroventricular de ocitocina ou do agonista do receptor de ocitocina PF-06655075, que não atravessa a barreira hematoencefálica (ou seja, não se difundiria para a periferia), mas não a administração sistêmica de PF-06655075 (ou seja, não atingiria o cérebro), diminuição do consumo de álcool. A administração de um antagonista do receptor de ocitocina restringido perifericamente não reverteu o efeito da ocitocina intranasal no consumo de álcool. Ex vivo registros eletrofisiológicos de neurônios CeA indicaram que a oxitocina diminui a transmissão evocada de GABA em ratos não dependentes, mas não em ratos dependentes, enquanto a oxitocina diminuiu a amplitude das respostas GABAérgicas espontâneas em ambos os grupos. A ocitocina bloqueou os efeitos facilitadores do álcool agudo na liberação de GABA no CeA de ratos dependentes, mas não não dependentes. Juntos, esses resultados fornecem evidências convergentes de que a ocitocina bloqueia específica e seletivamente a motivação aprimorada para o consumo de álcool que se desenvolve na dependência de álcool, provavelmente por meio de um mecanismo central que pode resultar de efeitos alterados da ocitocina na transmissão de CeA GABA na dependência de álcool. Neuroadaptações na sinalização de ocitocina endógena podem fornecer um mecanismo para aprofundar nossa compreensão do transtorno por uso de álcool.
Resumo do autor
O transtorno por uso de álcool é caracterizado por uma redução na função de recompensa e ganho na função de estresse. O neuropeptídeo oxitocina está envolvido na regulação dos sistemas de recompensa e estresse. Testamos a hipótese de que a administração de ocitocina poderia normalizar as desregulações que ocorrem na dependência de álcool e, assim, reduzir o consumo de álcool em ratos dependentes. Demonstramos que a ocitocina administrada sistemicamente, intranasalmente ou no cérebro bloqueou o aumento do consumo exibido por ratos dependentes de álcool. Esses efeitos demonstraram ser mediados centralmente e não perifericamente. A ocitocina bloqueou esse aumento do consumo de álcool em doses que não alteraram os comportamentos não relacionados ao álcool ou o consumo de álcool em ratos não dependentes, sugerindo que o efeito era específico para o consumo de álcool na dependência de álcool. Ex vivo registros eletrofisiológicos no núcleo central da amígdala (CeA; uma região cerebral chave na rede de desregulações induzidas pela dependência de álcool) indicaram que a oxitocina bloqueou os efeitos facilitadores do álcool na sinalização inibitória em ratos dependentes, mas não não dependentes. Esses resultados fornecem evidências convincentes de que a desregulação no sistema de ocitocina endógeno é de relevância funcional para uma compreensão mecanicista do transtorno por uso de álcool.
figuras
Citação: Tunstall BJ, Kirson D, Zallar LJ, McConnell SA, Vendruscolo JCM, Ho CP, et al. (2019) A oxitocina bloqueia a motivação aprimorada para o álcool na dependência de álcool e bloqueia os efeitos do álcool na transmissão GABAérgica na amígdala central. PLoS Biol 17(4): e2006421. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006421
Editor acadêmico: Richard Daneman, UCSD, Estados Unidos da América
Recebido: April 23, 2018; Aceitaram: Março 8, 2019; Publicado em: 16 de abril de 2019
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Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do documento e seus arquivos de informações de suporte.
Financiamento: Instituto Nacional de Abuso de Drogas—Programa de Pesquisa Intermural (número de concessão N/A) apoiou BJT, GFK, LFV. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. Institutos Nacionais de Saúde (concessão número F32 AA02526) concedido a DK. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. Institutos Nacionais de Saúde (concessão número AA015566) concedido ao MR. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. Institutos Nacionais de Saúde (concessão número AA017447) concedido ao MR. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. National Institutes of Health (concessão número P60 AA006420) concedida ao MR. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. Institutos Nacionais de Saúde (concessão número K99 AA026638) concedido a DK. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Abreviaturas: aCSF, líquido cefalorraquidiano artificial; CeA, núcleo central da amígdala; CRF, fator liberador de corticotropina; DL-AP5, DL-2-amino-5-fosfonovalerato; DNQX, 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona; eIPSP, potencial pós-sináptico inibitório evocado; FR1, razão fixa 1; E/S, entrada-saída; IACUC, Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais; mIPSC, corrente pós-sináptica inibitória em miniatura; NPY, neuropeptídeo Y; OTA, desGly-NH2-d(CH2)5[D-Tyr2,Thr4]OVT; PPR, razão de pulsos pareados; PR, razão progressiva; RM ANOVA, ANOVA de medidas repetidas; rPOD, dispositivo olfativo de precisão de rato; sIPSC, corrente pós-sináptica inibitória espontânea; TGOT, (Thr2,Gly5)-oxitocina; TMA, (d(CH2)8,Tyr(Me)XNUMX,ArgXNUMX)-Vasopressina; TTX, Tetrodotoxina
Introdução
O transtorno por uso de álcool é um problema de saúde pública global; 6% da população mundial está sujeita a morbidade e mortalidade por álcool.1]. A dependência de álcool (refletindo disfunção equivalente ao transtorno por uso de álcool moderado a grave) é um transtorno crônico e recorrente que se desenvolve como resultado de neuroadaptações nos sistemas de recompensa, estresse e funções executivas do cérebro controlados por neurocircuitos que envolvem os gânglios da base, amígdala estendida e córtex pré-frontal, respectivamente [2]. Na dependência de álcool, a motivação para buscar e consumir álcool é impulsionada pela hipofunção da recompensa e pela sensibilização ao estresse. Ambos os processos contribuem para um estado emocional negativo que aumenta a motivação para o consumo de álcool por meio de reforço negativo.3,4].
Acredita-se que a ocitocina tenha um papel importante no comportamento social, no medo e na ansiedade, no aprendizado e na memória.5]. Estudos recentes de mapeamento optogenético e neuroanatômico avançaram nossa compreensão da complexidade do neurocircuito da ocitocina e do papel da sinalização pelo sistema de ocitocina endógeno em vários comportamentos.6]. A ocitocina modula o estresse e a função de recompensa e tem sido sugerida como um tratamento putativo para o vício.7]. Relatos de que a administração de ocitocina pode reduzir o consumo de drogas, abstinência e recaídas associadas a várias drogas de abuso em modelos pré-clínicos aumentaram muito o interesse nessa área.8,9]. De fato, a oxitocina diminuiu a demanda econômica por estimulantes.10], restabelecimento da procura de estimulantes [11,12], tolerância a opióides e abstinência [13], e desenvolvimento de tolerância ao álcool [7]. Particularmente relevante para o tratamento da dependência do álcool, a oxitocina tem um perfil anti-stress e anti-ansiedade [14]. Estudos clínicos preliminares demonstraram que a administração de ocitocina intranasal reduziu a ansiedade relacionada à abstinência de álcool e o desejo por álcool em pacientes dependentes de álcool em abstinência precoce.15], redução do desejo por álcool em indivíduos ansiosos dependentes de álcool [16], e redução da resposta neural aos sinais de álcool em bebedores sociais pesados [17]. A ocitocina diminuiu o consumo de álcool em ratos não dependentes [18,19], bebedeira em camundongos [20,21], e reintegração induzida por sugestão em ratos pós-dependentes [17]. No entanto, os efeitos da ocitocina sobre o consumo de álcool e a motivação para o álcool em ratos dependentes de álcool ainda precisam ser determinados. Portanto, no presente estudo, usamos um modelo de exposição crônica intermitente ao vapor de álcool para induzir a dependência de álcool e aumentar a motivação para o álcool. Este modelo tem excelente validade preditiva, permitiu a dissociação da neurobiologia subjacente ao comportamento dependente de álcool versus não dependente e tem sido usado para determinar a provável contribuição de uma série de sistemas neurobiológicos para o transtorno por uso de álcool.3,39].
A ocitocina foi detectada no cérebro após administração intraperitoneal e intranasal em camundongos e ratos.22-24]. Os receptores de ocitocina são encontrados no cérebro e em vários tecidos periféricos, onde a ligação media o papel clássico da ocitocina na lactação, parto e reflexos sexuais em machos e fêmeas.25]. Existem vários outros locais de ligação da ocitocina na periferia, incluindo o intestino, coração, sistema vascular e nervo vago, que podem contribuir para os efeitos comportamentais da ocitocina, incluindo a inibição do apetite e do medo.25,26]. As contribuições centrais versus periféricas para os efeitos putativos da ocitocina no consumo de álcool também precisam ser determinadas.
Os receptores de ocitocina são encontrados em muitas regiões do cérebro relevantes para a dependência de álcool, como a amígdala estendida em ratos e humanos, incluindo o núcleo central da amígdala (CeA).27,28]. O CeA é bem descrito como uma estrutura chave envolvida na transição para dependência de drogas e álcool.2,29]. O silenciamento de um conjunto neuronal CeA ativado por abstinência de álcool bloqueou o aumento do consumo associado à dependência de álcool.30]. A maioria dos neurônios CeA são GABAérgicos, e o aumento da sinalização de GABA no CeA está ligado à dependência de álcool. Infusão intra-CeA de um GABAA agonista do receptor diminuiu o consumo de álcool em ratos dependentes de álcool [31]. Nós demonstramos anteriormente que a transmissão espontânea e evocada de GABA está aumentada em CeA de ratos dependentes de álcool [32]. Ambos os neuropeptídeos pró e antiestresse interagem com a sinalização CeA GABA e modulam bidirecionalmente o consumo de álcool. Foi relatado que a ocitocina interage com a sinalização GABAérgica e pode bloquear os efeitos agudos do álcool por meio de uma ação direta no GABAA receptores [33]. No entanto, os efeitos fisiológicos da ocitocina CeA na dependência de álcool são atualmente desconhecidos.
Portanto, no presente estudo, testamos a hipótese de que a ocitocina diminui o consumo de álcool e a motivação para o álcool especificamente em ratos dependentes de álcool por meio de ações centrais e não periféricas. Além disso, hipotetizamos que a dependência do álcool alteraria a forma como a ocitocina modula a sinalização de GABA no CeA.
Materiais e métodos
Declaração de ética
Para todos os experimentos comportamentais e eletrofisiológicos envolvendo anestesia, foi utilizada a inalação de isoflurano. Para experimentos eletrofisiológicos, a anestesia foi seguida de decapitação rápida para permitir a preparação do corte cerebral. Todos os estudos comportamentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (ACUC) do National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program. Todos os procedimentos eletrofisiológicos foram aprovados pelo IACUC do The Scripps Research Institute. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8ª edição).
Animais
Ratos usados em estudos comportamentais (machos Wistar, n = 86; Charles River, Kingston, NY) e eletrofisiologia (macho Sprague-Dawley, n = 87; Charles River, Raleigh, NC) pesavam de 225 a 275 g na chegada, foram alojados em grupo (2 a 3 por gaiola) em gaiolas de plástico padrão em uma sala com temperatura e umidade controladas e foram mantidas sob um reverso 12 h/ Ciclo claro/escuro de 12 h com comida e água disponíveis ad libitum, exceto durante os testes comportamentais.
Drogas
Para experimentos comportamentais, o álcool (etanol; Warner Graham, Cockeysville, MD) foi dissolvido em água da torneira. A ocitocina (ChemPep Inc., Wellington, FL) foi dissolvida em solução salina a 0.9%. Para administração periférica, o agonista do receptor de ocitocina não penetrante da barreira hematoencefálica PF-06655075 foi inicialmente dissolvido em 10% (v/v) Sistema de Liberação de Fármaco Autoemulsificante que consistia em 3:4:3 Miglyol 812:Cremophor RH40:Capmul MCM (v/v/v). A emulsão foi completada com 90% (v/v) de tampão de fosfato aquoso 50 mM (pH 7.4). Para administração intracerebroventricular, PF-06655075 foi inicialmente dissolvido em 5% (v/v) de dimetilsulfóxido, depois combinado com 5% (v/v) de polietilenoglicol 300 e completado com 90% (v/v) de solução salina. O PF-06655075 e o veículo utilizado para sua administração periférica foram gentilmente cedidos pela Pfizer. O antagonista não penetrante da barreira hematoencefálica L-371,257 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO) foi preparado em um veículo de 5% (v/v) dimetilsulfóxido, 5% (v/v) Cremophor e 90% (v /v) água estéril.
Para experimentos de eletrofisiologia, ocitocina e o antagonista seletivo do receptor de vasopressina 1A (d(CH2)5,Tyr(Me)2,Arg8)-Vasopressina (TMA) [34] foram obtidos de Tocris (Ellisville, MO). O antagonista seletivo do receptor de ocitocina desGly-NH2-d(CH2)5[D-Tyr2,Thr4]OVT (OTA) foi fornecido pelo Dr. Maurice Manning (Universidade de Toledo, OH) [34]. CGP 55845A, DL-2-amino-5-fosfonovalerato (DL-AP5) e 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona (DNQX) foram obtidos de Tocris (Ellisville, MO). A tetrodotoxina (TTX) foi adquirida da Biotium (Hayward, CA). O álcool foi adquirido da Remet (La Mirada, CA, EUA). Todas as drogas foram dissolvidas em líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF).
Autoadministração de álcool operante e exposição ao vapor de álcool
Os experimentos de autoadministração de álcool oral foram conduzidos em câmaras operantes padrão (Med Associates, St. Albans, VT) equipadas com 2 alavancas retráteis e um receptáculo de líquido de copo duplo. Após o treinamento inicial, conforme descrito anteriormente [29,35], os animais foram autorizados a pressionar a alavanca para álcool (10%, p/v; 0.1 ml) e água (0.1 ml) em alavancas separadas de acordo com um esquema de reforço simultâneo de razão fixa 1 (FR1) (cada pressão de alavanca resultou na entrega de fluidos) em sessões operantes de 30 minutos. Após cada sessão de treinamento, o receptáculo de líquido e a área circundante foram inspecionados para confirmar o consumo dos reforçadores ganhos. Após a aquisição da resposta, os ratos foram divididos em 2 grupos pareados pelo consumo de álcool. Para o restante desses experimentos, os ratos do grupo não dependente foram expostos ao ar sem álcool, enquanto os ratos do grupo dependente foram expostos ao vapor de álcool em ciclos diários projetados para causar intoxicação (vapor de 14 h “ligado”; meta de 200 mg/dl níveis de álcool no sangue) e abstinência (10 h de vapor “off”) para induzir dependência de álcool, conforme descrito anteriormente [29,35]. A dependência é caracterizada por sinais somáticos e motivacionais de abstinência que incluem aumento do comportamento do tipo ansiedade, déficits de recompensa e maior motivação para a autoadministração de álcool.36-39]. Em todos os experimentos de autoadministração de álcool operante, o consumo de base estável de álcool foi estabelecido em ratos dependentes e não dependentes antes do início dos testes farmacológicos. Sessões de autoadministração de álcool operante, incluindo testes farmacológicos, foram realizadas 2 a 3 sessões por semana (nunca em dias consecutivos para minimizar potenciais efeitos de transmissão) durante o período de 10 h “off”, 6 a 8 h após a retirada.
Efeito da ocitocina intraperitoneal na ingestão de álcool (FR1) e motivação (razão progressiva)
Ocitocina intraperitoneal (0, 0.125, 0.25, 0.5 e 1 mg/kg; 0.5 ou 1 ml/kg) foi administrada 30 min antes das sessões de autoadministração de álcool FR1 em dependentes (n = 10) e não dependente (n = 10) ratos. O tempo de pré-tratamento foi selecionado com base em trabalhos anteriores que determinaram as concentrações de pico de ocitocina cerebral após a administração intraperitoneal de ocitocina [22]. A ordem do teste de doses intraperitoneais foi contrabalançada usando um design quadrado latino dentro dos sujeitos. A autoadministração de álcool e água foi registrada durante os testes. Com base nos resultados do teste FR1, as doses intraperitoneais de 0, 0.125 e 0.25 mg/kg foram então testadas em um esquema de reforço de razão progressiva (PR), no qual o número de pressões de alavanca necessárias para obter o próximo reforçador de álcool aumentou progressivamente , da seguinte forma: 1, 1, 2, 2, 3, 3, 4, 4, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11, 11, 13, 13, etc. A última proporção concluída (ponto de interrupção) foi usado como uma indicação de motivação para o álcool. Durante o teste de PR, apenas a alavanca de álcool foi disponibilizada. As sessões duraram 90 minutos ou até 15 minutos sem resposta. O tempo de pré-tratamento durante o teste PR foi o mesmo do teste FR1. Novamente, essas doses foram administradas em um desenho quadrado latino, com dias intermediários sem testes.
Efeito da ocitocina intranasal na ingestão de álcool (FR1) e motivação (PR)
Para restabelecer uma linha de base estável de ingestão, os mesmos ratos descritos acima foram movidos para diferentes câmaras operantes com manipulação operante e receptáculos de reforço correspondentes. Eles foram autorizados a oito sessões de FR30 de 1 minutos para obter álcool e água (S1 Fig). Em seguida, a oxitocina intranasal foi administrada 1 h antes do teste de resposta ao álcool nos esquemas de reforço FR1 e PR (descritos acima). O tempo de pré-tratamento foi selecionado com base em trabalhos anteriores que determinaram as concentrações de pico de ocitocina cerebral após a administração intranasal de ocitocina [22]. Novamente, os testes foram conduzidos em designs de quadrados latinos com dias intermediários de não teste. Para administração intranasal de drogas, a anestesia geral foi rapidamente induzida por isoflurano (5% por 2 a 5 min) e, em seguida, os ratos receberam imediatamente ocitocina intranasal (0, 0.25, 0.5 e 1 mg/kg/20 μl; com base no FR1 dados, as doses intranasais de 0.5 e 1 mg/kg/20 μl foram selecionadas para testes no cronograma PR) usando o dispositivo olfativo de precisão de rato (rPOD; Impel NeuroPharma, Seattle, WA) e deixados para se recuperar antes de serem devolvidos à sua casa cela.
Efeito da ocitocina sistêmica e intranasal na locomoção, higiene, coordenação motora e consumo de soluções palatáveis não alcoólicas
Com base nos efeitos da ocitocina no consumo de álcool e na motivação para o álcool, selecionamos as doses de ocitocina intraperitoneal (0.25 mg/kg) e intranasal (1 mg/kg) para testes comportamentais adicionais. Essas doses por cada via foram a dose mais baixa por cada via que reduziu significativamente o consumo de álcool e a motivação para o álcool especificamente em ratos dependentes. Os tempos de pré-tratamento foram os mesmos usados para testes de autoadministração de álcool.
Testes comportamentais foram conduzidos em coortes separadas de ratos para avaliar os potenciais efeitos não específicos do álcool da ocitocina na locomoção e higiene em campo aberto (dependente, n = 6; não dependente, n = 6) e coordenação motora em um rotarod (dependente, n = 5; não dependente, n = 7). Dois observadores cegos pontuaram quaisquer instâncias de comportamento de higiene de acordo com o trabalho publicado anteriormente. Um único ponto foi dado para cada ocorrência de vibração das patas dianteiras, lavagem do rosto, higiene corporal, coçar o corpo, lamber as patas, sacudir a cabeça, sacudir o corpo e cuidar da genitália, de acordo com estudos relatados anteriormente.40,41]. Os pontos foram somados para cada animal para produzir uma pontuação de higiene.
Além do efeito farmacológico do álcool, o álcool contém calorias e tem um componente de sabor adocicado que contribui para a eficácia reforçadora do álcool. Para avaliar o papel potencial das calorias e do sabor doce na capacidade da ocitocina intraperitoneal e intranasal de reduzir o consumo de álcool, testamos a ocitocina no consumo de um reforçador calórico não alcoólico sem sabor doce (5% de maltodextrina; n = 7) e em solução doce não alcoólica e sem conteúdo calórico (0.1% de sacarina; n = 8; detalhes adicionais fornecidos em Texto S1).
Mediação central versus periférica do efeito da ocitocina na ingestão de álcool
Três coortes separadas de ratos dependentes de álcool foram usadas (administração central de ocitocina: n = 6; agonista do receptor de ocitocina periférico: n = 9; antagonista do receptor de ocitocina periférico combinado com administração de ocitocina intranasal: n = 12). Um subconjunto do grupo usado para testar o antagonista do receptor de ocitocina periférico combinado com a administração de ocitocina intranasal recebeu 2 sessões na ausência de qualquer tratamento para restabelecer uma linha de base e, em seguida, usado para testar o efeito da administração central do agonista do receptor de ocitocina PF-06655075 (agonista do receptor central de ocitocina: n = 7). As coortes de administração central de ocitocina e PF-06655075 foram implantadas cirurgicamente com uma cânula guia para permitir a administração intracerebroventricular desses compostos.
O antagonista do receptor de ocitocina L-371,257, que não atravessa a barreira hematoencefálica, foi testado em combinação com a administração intranasal de ocitocina para testar a capacidade do antagonismo periférico de reverter a capacidade da ocitocina intranasal de reduzir o consumo de álcool em ratos dependentes. L-371,257 é um antagonista potente e competitivo do receptor de ocitocina (pA2 = 8.4) com alta afinidade tanto no receptor de ocitocina (Ki = 19 nM) quanto no receptor V1a de vasopressina (Ki = 3.7 nM) [42]. O tempo e a dose de pré-tratamento (45 min; 5 mg/kg) foram selecionados para exceder as doses que forneceram o bloqueio das contrações uterinas induzidas por ocitocina por pelo menos várias horas após a administração periférica (intravenosa ou intraduodenal) em ratos [42]. Doses muito mais baixas do que isso em ratos (0.5 mg/kg intraperitoneal) [43] e camundongos (300 μg/kg intranasal) [44,45] demonstraram fornecer antagonismo comportamentalmente eficaz. Além disso, em estudos anteriores, doses comparáveis de L-371,257 versus oxitocina (0.5 mg/kg versus 0.5 mg/kg intraperitoneal em ratos [43]; 300 μg/kg versus 200 μg/kg intranasal em camundongos [45]) foram administrados. Aqui, administramos 5 vezes a dose do antagonista em comparação com a ocitocina (5 mg/kg versus 1 mg/kg) por meio de uma via preferida de absorção periférica (injeção intraperitoneal versus aplicação intranasal [23]) para testar conservadoramente a capacidade do antagonista de ação periférica de alterar as ações da ocitocina intranasal. Os ratos foram testados em um desenho quadrado latino dentro dos indivíduos com as seguintes combinações de tratamentos intraperitoneais e intranasais: veículo intraperitoneal com veículo intranasal, veículo intraperitoneal com ocitocina intranasal (1 mg/kg/20 μl), L-371,257 intraperitoneal (5 mg /kg/ml) com veículo intranasal e L-371,257 intraperitoneal (5 mg/kg/ml) com ocitocina intranasal (1 mg/kg/20 μl). Foi realizado treinamento operante e indução de dependência, conforme descrito acima.
Para testar o efeito do agonismo do receptor de ocitocina central versus periférico no consumo de álcool induzido pela dependência, administramos central ou perifericamente uma molécula grande de ação prolongada que não penetra na barreira hematoencefálica (PF-06655075). Para administração central, 7 ratos foram implantados cirurgicamente com uma cânula guia para permitir a administração intracerebroventricular de PF-06655075. Esses ratos foram usados anteriormente para testar o antagonista do receptor de ocitocina periférico combinado com a administração de ocitocina intranasal (dados mostrados em Fig 3B). A dose PF-06655075 de 30 μg foi selecionada para administração intracerebroventricular para corresponder à dose mais alta de ocitocina administrada pela mesma via, uma dose que bloqueou o consumo de álcool em ratos dependentes de álcool. Para administração periférica, os ratos receberam 1 mg/kg de PF-06655075 por via subcutânea. Esta dose foi selecionada levando em consideração a alta ligação às proteínas plasmáticas de PF-06655075 (ou seja, resultando em concentrações não ligadas mais baixas do que a oxitocina), bem como sua ligação ao receptor de oxitocina Ki. Espera-se que a administração subcutânea de 1 mg/kg de PF-06655075 versus 1 mg/kg de ocitocina produza ocupação do receptor comparável (94.2% versus 99.7% em Cmax; ver Texto S1 para cálculos baseados em dados de Modi e colegas [26]). Portanto, esperava-se que 1 mg/kg de PF-06655075 subcutâneo recapitulasse a ligação periférica putativa da ocitocina. Essa hipótese foi baseada na observação de que doses menores de ocitocina intraperitoneal foram suficientes para bloquear o consumo de álcool em ratos dependentes de álcool no presente estudo. Especificamente, 0.25 mg/kg de ocitocina intraperitoneal reduziu o consumo de álcool em ratos dependentes em uma extensão semelhante a 30 μg de ocitocina intracerebroventricular. Finalmente, esta dose sistêmica de 1 mg/kg de PF-06655075 foi relatada para reduzir o comportamento de medo potencialmente através da ação anti-simpática na periferia.26].
eletrofisiologia
Ratos dependentes e não dependentes foram profundamente anestesiados com isoflurano seguido de decapitação rápida e remoção imediata do cérebro em uma solução de corte de fatia de cérebro de alta sacarose gelada (sacarose 206 mM; KCl 2.5 mM; CaCl2 0.5 mM; MgCl2 7 mM; NaH2PO4 1.2 mM; NaHCO3 26 mM; glicose 5 mM; HEPES 5 mM [pH 7.4]). Fatias coronais (300 a 400 μm) contendo o CeA foram continuamente superfundidas (taxa de fluxo de 2 a 4 ml/min) com 95% de O2/ 5% CO2 aCSF equilibrado da seguinte composição: NaCl 130 mM, KCl 3.5 mM, NaH2PO4 1.25 mM, MgSO4H7O 2 mM, CaCl1.5 2 mM, NaHCO2.0 3 mM e glicose 24 mM. Os registros foram realizados em neurônios da subdivisão medial do CeA. Cada grupo experimental continha neurônios de um mínimo de 10 ratos. A atividade GABAérgica foi isolada farmacologicamente com DNQX, DL-AP3 e CGP. Todas as drogas foram aplicadas por banho de superfusão.
Registramos com micropipetas afiadas preenchidas com 3M KCl e evocamos potenciais pós-sinápticos inibitórios GABAérgicos (eIPSPs) estimulando localmente dentro da subdivisão medial de CeA através de um eletrodo bipolar. Os neurônios foram mantidos próximos ao seu potencial de membrana de repouso (-82.4 ± 0.8 mV). Realizamos um protocolo de entrada-saída (I/O) que consiste em uma faixa de 5 estimulações de corrente, começando na corrente de limiar necessária para induzir um eIPSP, até a força necessária para induzir a amplitude sublimiar máxima. A intensidade média do estímulo foi usada para monitorar as mudanças induzidas pela droga ao longo da duração do experimento. A razão de pulso pareado (PPR) foi realizada na intensidade do estímulo dando aproximadamente 50% da amplitude máxima determinada no protocolo de E/S.
Gravações de grampo de voltagem de célula inteira de correntes pós-sinápticas inibitórias espontâneas GABAérgicas (sIPSCs) e correntes pós-sinápticas inibitórias em miniatura (mIPSCs) foram de neurônios CeA visualizados presos a -60 mV durante as gravações. As pipetas de patch (3 a 6 MΩ) foram preenchidas com uma solução interna composta do seguinte (em mM): 145 KCl, 0.5 EGTA, 2 MgCl2, 10 HEPES, 2 Na-ATP e 0.2 Na-GTP. Em todos os experimentos, células com resistência em série superior a 25 MΩ foram excluídas da análise e a resistência em série foi monitorada continuamente durante a gravação sem intervalo com um pulso de 10 mV. As células em que a resistência em série mudou mais de 25% durante o experimento foram excluídas da análise. Todas as medidas foram realizadas antes (linha de base) e durante a aplicação do medicamento (detalhes em Texto S1).
Análise estatística
Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média. O nível de significância foi estabelecido como p < 0.05. As análises estatísticas foram realizadas no Prism 6 (Graphpad Software, Inc., La Jolla, CA). Os dados comportamentais foram analisados com análise de variância de medidas repetidas (RM ANOVA) de uma via (Dose, Sessão ou Tratamento), RM ANOVA de duas vias (Grupo × Dose) ou por amostras pareadas t teste. O teste de Holms-Sidak foi usado para comparações post hoc. Os dados eletrofisiológicos foram analisados com ANOVA de duas vias (Grupo × Concentração ou Grupo × Tratamento) seguido por comparações post hoc de Bonferroni, uma amostra t teste ou amostras independentes t teste, conforme o caso.
Resultados
Efeito da ocitocina intraperitoneal na ingestão de álcool (FR1) e motivação (PR)
Demonstrou-se que a exposição passiva ao vapor de álcool causa sinais somáticos de dependência na abstinência de álcool, bem como uma desregulação dos sistemas de recompensa e estresse. A característica cardinal do modelo é o aumento do consumo e motivação para o álcool exibido por ratos dependentes de álcool quando autorizados a realizar uma resposta operante para o acesso ao álcool.3]. Antes dos testes farmacológicos, ratos dependentes de álcool expostos a vapor de álcool crônico-intermitente exibiram um consumo de álcool significativamente maior em comparação com ratos não dependentes que foram expostos ao ar em sua gaiola durante todo o estudo.S1 Fig).
A ocitocina aboliu a diferença no consumo de álcool entre ratos dependentes e não dependentes em doses ≥ 0.25 mg/kg (Fig 1). Uma ANOVA de RM de 2 × 5 (Grupo × Dose) produziu uma interação significativa de Grupo × Dose (F4, 72 = 7.98, p 0.0001). Análises post hoc indicaram que os ratos dependentes autoadministraram significativamente mais álcool do que os ratos não dependentes após 0 (p 0.0001) e 0.125 mg/kg (p 0.001) doses de ocitocina, mas essa diferença desapareceu em doses mais altas. A resposta foi significativamente reduzida nas doses de 0.25, 0.5 e 1 mg/kg (todas p < 0.0001) em ratos dependentes em comparação com a condição de veículo, enquanto apenas a dose mais alta de 1 mg/kg reduziu significativamente a pressão de alavanca para álcool em ratos não dependentes (p < 0.05). Os dados de ingestão de água durante todos os testes são apresentados em S2 Fig.
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(A) Efeito da ocitocina intraperitoneal em reforçadores de álcool obtidos por ratos dependentes e não dependentes em sessões de 30 minutos de autoadministração de álcool. (B) Efeito da ocitocina intraperitoneal no ponto de interrupção do álcool em um esquema PR de reforço. (C) Efeito da ocitocina intranasal nos reforçadores alcoólicos obtidos por ratos dependentes e não dependentes em sessões de 30 minutos de autoadministração de álcool. (D) Efeito da ocitocina intranasal no ponto de interrupção do álcool em um esquema de reforço PR. #Diferença significativa entre ratos dependentes e não dependentes (p < 0.05). *Significativamente diferente da condição de controle dos respectivos grupos (0 mg/kg; p < 0.05). EtOH, etanol; FR1, razão fixa 1; IN, intranasal; IP, intraperitoneal; PR, razão progressiva.
A ocitocina (0.125 ou 0.25 mg/kg) eliminou seletivamente o aumento da motivação para o álcool em ratos dependentes.Fig 1B). Uma ANOVA de RM de 2 × 3 (Grupo × Dose) produziu uma interação significativa de Grupo × Dose (F2, 36 = 3.59, p < 0.05). A diferença no ponto de interrupção PR entre os grupos após o tratamento com veículo foi significativa (p < 0.05). Quando tratados com doses de 0.125 ou 0.25 mg/kg de ocitocina, os ratos dependentes não diferiram mais dos ratos não dependentes. A ocitocina (0.125 e 0.25 mg/kg) reduziu significativamente o ponto de quebra de PR para álcool em ratos dependentes (todos p < 0.01), enquanto a resposta no grupo não dependente não foi alterada pela ocitocina.
Efeito da ocitocina intranasal na ingestão de álcool (FR1) e motivação (PR)
A ocitocina intranasal diminuiu o consumo de álcool de forma dose-dependente em ratos dependentes sem afetar o consumo em ratos não dependentes.Fig 1C). A ANOVA RM 2 × 4 (Grupo × Dose) produziu uma interação significativa Grupo × Dose (F3, 54 = 14.18, p < 0.0001). Ratos dependentes ingeriram mais álcool do que ratos não dependentes tratados com solução salina, 0.25 e 0.5 mg/kg de ocitocina (todos p < 0.001). Esta diferença deixou de ser observada após o tratamento com 1 mg/kg de ocitocina. O consumo de álcool em ratos dependentes diminuiu significativamente nas doses de ocitocina em comparação com a condição salina (todos p < 0.0001), enquanto beber no grupo não dependente não foi alterado significativamente pela ocitocina.
No teste de RP (Fig 1D), ANOVA de RM de duas vias produziu uma interação Grupo × Dose significativa (F2, 36 = 4.27, p < 0.05). Após o tratamento com solução salina, os ratos dependentes tiveram um ponto de interrupção significativamente maior para o álcool do que os ratos não dependentes.t54 = 4.50, p < 0.001). Essa diferença não foi mais observada após a administração de 0.5 ou 1 mg/kg de ocitocina. A ocitocina (1 mg/kg) reduziu o ponto de quebra PR no grupo dependente (p < 0.001) sem alterar o comportamento de ratos não dependentes.
Efeito da ocitocina intraperitoneal e intranasal na locomoção, higiene, coordenação motora do rotarod e consumo de soluções palatáveis não alcoólicas
Ratos dependentes e não dependentes não foram significativamente diferentes em sua locomoção espontânea ou comportamento de limpeza. A ocitocina intraperitoneal (0.25 mg/kg) diminuiu significativamente a locomoção em ratos dependentes e não dependentes (Fig 2A; Dose: F1, 10 = 14.63, p < 0.01; testes post hoc todos p < 0.05), enquanto a ocitocina intranasal (1 mg/kg) não teve efeito em nenhum dos grupos. Os tratamentos com ocitocina intraperitoneal e intranasal não afetaram o comportamento de limpeza (que permaneceu mínimo durante o teste; Fig 2A inserir). Ratos dependentes e não dependentes não diferiram significativamente em seu desempenho de rotarod, e esse desempenho não foi significativamente alterado por tratamentos com ocitocina intraperitoneal ou intranasal.Fig 2B). A ocitocina intraperitoneal reduziu a sacarina (t6 = 2.80, p < 0.05) e maltodextrina (t6 = 3.20, p < 0.05) consumo, enquanto a ocitocina intranasal não teve efeito (Fig 2C).
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Efeito da ocitocina intraperitoneal (0.25 mg/kg) e intranasal (1 mg/kg) na locomoção espontânea (A) medida em um teste de 5 minutos em campo aberto. O painel de inserção mostra o comportamento de limpeza durante o teste colapsado em ratos dependentes e não dependentes; (B) coordenação motora medida em latência para queda em um teste de aceleração do rotarod; (C) consumo de soluções não alcoólicas palatáveis avaliadas em ratos treinados em um esquema FR1 para responder ao acesso a sacarina 0.1% doce/não calórica ou maltodextrina 5% calórica/não doce. *Significativamente diferente da solução salina (p < 0.05). Dep, dependente; FR1, razão fixa 1; IN, intranasal; IP, intraperitoneal; NãoDep, não dependente.
Efeito central versus periférico da ocitocina na ingestão de álcool
As sessões basais realizadas entre as sessões de teste de ocitocina intracerebroventricular não diferiram significativamente, então elas foram combinadas para análise (Fig 3A). Todas as doses de ocitocina intracerebroventricular reduziram o consumo de álcool em ratos dependentes (Dose: F3, 15 = 10.25, p < 0.001; testes post hoc: todos p <0.05).
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(A) Efeito da infusão intracerebroventricular de OXT em reforçadores de álcool obtidos por ratos dependentes em sessões de autoadministração de álcool de 30 minutos. (B) Efeito da administração periférica (intraperitoneal) do antagonista do receptor de OXT L-371,257 que não atravessa a barreira hematoencefálica na capacidade da OXT intranasal de reduzir os reforçadores de álcool obtidos por ratos dependentes em sessões de autoadministração de álcool de 30 minutos . (C) Efeito da administração central (intracerebroventricular) do agonista do receptor OXT (PF-06655075, uma molécula grande de ação prolongada que não atravessa a barreira hematoencefálica), em reforçadores obtidos por ratos dependentes em auto-álcool de 30 minutos -sessões de administração. (D) Efeito da administração sistêmica (subcutânea) de PF-06655075 em reforçadores obtidos por ratos dependentes em sessões de 30 minutos de autoadministração de álcool. *Significativamente diferente da condição de linha de base ou VEH (ambos no caso do painel C) (p < 0.05). OXT, oxitocina; VE, veículo.
O tratamento intranasal com ocitocina reduziu significativamente o consumo de álcool em ratos dependentes se os ratos foram pré-tratados com qualquer veículo (VEH + VEH versus VEH + OXT) ou com o antagonista do receptor de ocitocina restringido perifericamente L-371,257 (L-371,257 + VEH versus L-371,257 + OXT; Tratamento: F3, 33 = 10.73, p < 0.0001; testes post hoc: todos p < 0.05). L-371,257 não alterou significativamente o consumo de álcool por si só (VEH + VEH versus L-371,257 + VEH) nem reverteu a capacidade da ocitocina intranasal de reduzir o consumo de álcool em ratos dependentes (VEH + OXT versus L-371,257 + OXT; Fig 3B).
As sessões de linha de base realizadas entre as sessões de teste com administração intracerebroventricular de PF-06655075 não diferiram significativamente e, portanto, foram combinadas para análise (Fig 3C). A administração intracerebroventricular de PF-06655075, que não atravessa a barreira hematoencefálica e, portanto, não se difunde para a periferia, reduziu significativamente a resposta ao álcool em relação à linha de base e em relação ao veículo (Tratamento: F2, 12 = 42.25, p < 0.0001; testes post hoc: todos p < 0.0001). A administração do veículo não alterou significativamente a resposta em relação à linha de base (Fig 3C). A administração sistêmica de PF-06655075 (que se espera não atingir o cérebro) não alterou significativamente a resposta ao álcool em relação à linha de base ou à condição do veículo, nem o próprio veículo alterou significativamente a resposta em relação à linha de base (Fig 3D).
A ocitocina diminui a sinalização CeA GABAérgica evocada em ratos não dependentes, mas não dependentes
Registramos a partir de neurônios na subdivisão medial do CeA, usando configuração de célula inteira intracelular nítida para eIPSP inibitória GABAérgica localmente evocada e configuração de patch-clamp de célula inteira para correntes pós-sinápticas GABAérgicas. Não encontramos diferença na resistência de entrada de neurônios de ratos não dependentes (154.4 ± 11.4 MΩ) e dependentes (159.7 ± 7.6 MΩ) e nenhuma diferença na frequência de pico (S3 Fig) entre os grupos. As amplitudes GABAérgicas de eIPSP de linha de base estimuladas localmente dentro da subdivisão medial de CeA não foram diferentes entre animais não dependentes (9.7 ± 0.7 mV) e dependentes (9.9 ± 0.7 mV) (S4 Fig). Não foram observadas diferenças no PPR de eIPSPs no intervalo interestímulos de 100 ms em neurônios não dependentes (1.06 ± 0.08) e dependentes (1.01 ± 0.09).
Em neurônios CeA de ratos não dependentes, 100 nM de ocitocina (10 a 15 min) não alterou as amplitudes de eIPSP, enquanto 500 nM e 1,000 nM diminuíram significativamente as amplitudes para 83.4% ± 4.9% (t10 = 3.40, p < 0.01) e 74.1% ± 7.7% (t4 = 3.37, p < 0.05) da linha de base, respectivamente (Fig 4B). Notavelmente, em ratos dependentes, a oxitocina em todas as 3 concentrações não afetou os eIPSPs. Uma ANOVA de duas vias (Grupo × Concentração) produziu um efeito de Grupo significativo (F1,44 = 4.55, p < 0.05). A ocitocina não alterou a resistência de entrada de neurônios CeA não dependentes (linha de base: 144.3 ± 13.8 MΩ, ocitocina: 148.3 ± 13.7 MΩ) ou dependentes (linha de base: 148.2 ± 10.6 MΩ, ocitocina: 141.8 ± 12.9 MΩ), sugerindo que a ocitocina afeta as amplitudes de eIPSP não foram devido a alterações de excitabilidade, mas devido à diminuição da transmissão GABAérgica. A ocitocina (500 nM) aumentou significativamente o PPR de eIPSPs (PPR de linha de base: 0.98 ± 0.11; PPR de ocitocina: 1.35 ± 0.14; t10 = 2.56, p < 0.05) em ratos não dependentes, sugerindo uma possível diminuição na liberação pré-sináptica de GABA (já que as alterações no PPR são inversamente relacionadas às alterações na liberação) [46]. A ocitocina não alterou a PPR em ratos dependentes (PPR basal: 1.17 ± 0.22, PPR da ocitocina: 1.03 ± 0.07).
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(A) eIPSPs representativos registrados de neurônios CeA de ratos não dependentes (superiores) e dependentes (inferiores) antes (linha de base) e durante a aplicação aguda de ocitocina (500 nM), ocitocina com álcool (44 mM) e álcool sozinho. (B) Efeito de 3 concentrações de ocitocina (100, 500 e 1,000 nM) nas amplitudes de eIPSP em neurônios CeA de ratos dependentes e não dependentes de álcool. Concentrações mais altas de oxitocina (500 e 1,000 nM) diminuíram as amplitudes de eIPSP em ratos não dependentes, mas não em dependentes. (C) A ocitocina embotou o aumento induzido pelo álcool de eIPSP em neurônios de ratos dependentes e não dependentes de álcool. *Efeito significativo do medicamento em comparação com a linha de base (p <0.05). #Diferença significativa entre os grupos (p < 0.05). CeA, núcleo central da amígdala; eIPSP, potencial pós-sináptico inibitório evocado; EtOH, etanol; OT, ocitocina.
Álcool aumenta a transmissão CeA GABAérgica evocada
Álcool agudo (44 mM; dose máxima [47]) a aplicação aumentou significativamente as amplitudes de eIPSP no CeA de ambos não dependentes (para 140.8% ± 8.5% da linha de base; t7 = 4.79, p < 0.01) e ratos dependentes (até 133.9% ± 13.4% da linha de base; t6 = 2.53, p <0.05; Fig 4C), indicando uma falta de tolerância para os efeitos agudos do álcool na sinalização GABAérgica estimulada, como relatado anteriormente [47]. Além disso, o álcool não alterou a resistência de entrada de neurônios não dependentes (linha de base: 169.0 ± 19.2 MΩ, álcool: 167.6 ± 15.8 MΩ) ou dependentes (linha de base: 167.6 ± 10.4 MΩ, álcool: 161.4 ± 11.4 MΩ). Como a ocitocina também se liga aos receptores de vasopressina e há uma subpopulação CeA de neurônios sensíveis à ligação da vasopressina (especificamente, via receptor de vasopressina V1a, mas não V1b), sempre aplicamos o antagonista seletivo do receptor de vasopressina 1A TMA (500 nM) para isolar a ocitocina específica ações mediadas por receptores [34,48]. TMA não teve efeito nas amplitudes de eIPSP (não dependente: 8.51 ± 1.08 mV e dependente: 9.68 ± 1.31 mV sem TMA) e não afetou a magnitude do aumento induzido pelo álcool de eIPSPs em ambos não dependentes (para 148.6% ± 10.5% da linha de base ; t5 = 4.64, p < 0.01) e ratos dependentes (129.8% ± 10.6% da linha de base; t6 = 2.80, p <0.05; S5 Fig).
Para determinar potenciais interações entre ocitocina e álcool agudo, na maioria dos neurônios que receberam 500 nM de ocitocina, aplicamos álcool na presença de ocitocina. Nesse subconjunto de neurônios (7 de 9) de fatias não dependentes, a coaplicação de álcool induziu apenas um aumento moderado e não significativo das amplitudes de eIPSP (oxitocina: 83.4% ± 4.9%; oxitocina + álcool: 101.7% ± 8.3% da linha de base; Fig 4C). No subconjunto de neurônios (12 de 15) de fatias dependentes, o álcool não aumentou ainda mais eIPSPs (oxitocina: 107.6% ± 9.3%; oxitocina + álcool: 123.0% ± 16.8% da linha de base; Fig 4C), sugerindo um bloqueio da transmissão diminuída de GABA induzida por ocitocina em ratos dependentes. Uma ANOVA de duas vias (Grupo × Tratamento) produziu um efeito principal significativo do Tratamento (F2,53 = 6.33, p < 0.01), e um teste post hoc de Bonferroni indicou uma diferença significativa entre os efeitos do álcool e da ocitocina (t53 = 3.35, p < 0.01). Da mesma forma, a ocitocina a 100 e 1,000 nM embotou a facilitação induzida por álcool de eIPSPs em fatias não dependentes (84.2% ± 11.0% e 82.1% ± 13.2% da linha de base, respectivamente) e dependentes (124.0% ± 18.6% e 125.5% ± 15.3 % da linha de base, respectivamente). No geral, a ocitocina embotou o aumento da transmissão de GABA induzido pelo álcool (ver Fig 4C).
Ocitocina diminui CeA GABAA função do receptor
Para investigar ainda mais a ação pré versus pós-sináptica da ocitocina na sinalização GABA, realizamos gravações de patch-clamp de células inteiras de sIPSCs e mIPSCs em neurônios CeA. Geralmente, as alterações na frequência do IPSC refletem a liberação alterada do transmissor e as alterações na amplitude ou cinética refletem alterações no GABA pós-sinápticoA sensibilidade do receptor. No entanto, a amplitude alterada também pode refletir uma mistura de efeitos pré e pós-sinápticos.49,50].
Nós primeiro investigamos sIPSCs, não encontrando diferenças significativas entre ratos não dependentes e dependentes na frequência de sIPSC (1.1 ± 0.2 e 0.8 ± 0.1 Hz, respectivamente), amplitude (82.0 ± 8.4 e 66.6 ± 5.8 pA, respectivamente), tempo de subida (2.6 ± 0.1 e 2.8 ± 0.1 ms, respectivamente), ou tempo de decaimento (8.0 ± 0.8 e 9.4 ± 1.0 ms, respectivamente). Em seguida, usamos o antagonista do receptor de vasopressina 1A TMA e não encontramos efeitos do TMA sozinho em ratos não dependentes ou dependentes.S6 Fig), como observado para respostas GABAérgicas evocadas. Em neurônios CeA de ratos não dependentes, a aplicação de 500 nM de ocitocina diminuiu significativamente a amplitude das sIPSCs para 85.2% ± 6.7% da linha de base (t11 = 2.22, p < 0.05) e tempos de subida aumentados para 110.5% ± 4.7% da linha de base (t11 = 2.24, p < 0.05) sem alterações na frequência ou tempos de decaimento (Fig 5A), indicando principalmente ações pós-sinápticas da ocitocina para diminuir o GABAA função do receptor. Em ratos dependentes (Fig 5A), a ocitocina também diminuiu significativamente a amplitude de sIPSC para 83.1% ± 5.0% da linha de base (t8 = 3.37, p < 0.01), sem alterações na frequência ou cinética da sIPSC.
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(A, Topo) Representante GABAAsIPSCs mediadas de neurônios CeA de ratos não dependentes e dependentes antes (linha de base) e durante a aplicação de ocitocina (500 nM). (A, Inferior) A ocitocina diminuiu a amplitude de sIPSC da linha de base em neurônios CeA de ratos não dependentes e dependentes e causou um pequeno aumento da linha de base no tempo de elevação de sIPSC em ratos não dependentes. No entanto, não houve diferenças significativas entre os neurônios de ratos não dependentes e dependentes nessas medidas. (B, Superior) Representante GABAAmIPSCs mediadas de neurônios CeA de ratos não dependentes e dependentes com TTX e durante a aplicação de ocitocina (500 nM). (B, Inferior) A ocitocina não teve efeito na frequência, amplitude ou cinética de mIPSC em neurônios CeA de ratos não dependentes e dependentes. (C) sIPSCs representativas de neurônios CeA de ratos não dependentes (esquerda) e dependentes (direita) antes e durante a aplicação de álcool (44 mM), ocitocina (500 nM) e ocitocina com álcool. (D) Nos neurônios que receberam ocitocina e ocitocina com álcool, a ocitocina não teve efeito significativo na frequência de sIPSC da linha de base em ratos não dependentes ou dependentes. No entanto, o álcool com ocitocina aumentou significativamente a frequência de sIPSC da ocitocina isolada apenas em ratos não dependentes. (E) Nesses mesmos neurônios, a oxitocina diminuiu a amplitude das sIPSCs da linha de base em ratos dependentes, mas sem efeitos significativos da história de drogas ou álcool. (F) A ocitocina e a coaplicação de ocitocina com álcool aumentaram o tempo de subida da linha de base apenas em neurônios de ratos não dependentes, sem efeitos significativos da história de drogas ou álcool. (G) Álcool com oxitocina aumentou os tempos de decaimento de sIPSC de oxitocina sozinha apenas em ratos não dependentes. (H) O álcool sozinho aumentou a frequência de sIPSCs da linha de base em ratos não dependentes e dependentes, mas sem efeitos significativos da história de drogas ou álcool quando comparado ao álcool com ocitocina. O álcool não teve efeito na amplitude (I), nos tempos de subida (J) ou nos tempos de decaimento (K) em ratos não dependentes ou dependentes, mas o aumento do álcool com ocitocina nos tempos de subida em ratos não dependentes foi significativamente diferente do efeito do álcool sozinho. J). (L) sIPSCs representativas de neurônios CeA de ratos dependentes com o antagonista do receptor de ocitocina OTA (100 nM), durante a ocitocina (500 nM) e durante a coaplicação subsequente de ocitocina com álcool 44 mM. (M) OTA bloqueou os efeitos da ocitocina na amplitude da sIPSC e a aplicação subsequente de álcool aumentou a frequência da sIPSC. *Significativamente diferente da linha de base ou condição de controle (p <0.05). #Diferença significativa entre os grupos (p < 0.05). Amp, amplitude; CeA, núcleo central da amígdala; EtOH, etanol; Freq, frequência; mIPSC, corrente pós-sináptica inibitória em miniatura; OT, oxitocina; OTA, desGly-NH2-d(CH2)5[D-Tyr2,Thr4]OVT; sIPSC, corrente pós-sináptica inibitória espontânea; TTX, tetrodotoxina.
Em seguida, investigamos mIPSCs na presença do bloqueador de canal de sódio TTX para isolar correntes independentes de potencial de ação. Geralmente, a análise de mIPSC revela efeitos específicos de drogas na liberação vesicular de GABA, que resulta da exocitose de vesículas contendo neurotransmissores de maneira independente dos mecanismos de liberação induzidos pelo potencial de ação. Além disso, sIPSCs e mIPSCs provavelmente resultam de mecanismos distintos de liberação de neurotransmissores pré-sinápticos, por exemplo, maquinaria de fusão de vesículas, segregação espacial das vesículas e/ou populações de vesículas e dinâmica do pool de vesículas sinápticas [51]. Semelhante às sIPSCs, não encontramos diferenças de linha de base entre ratos não dependentes e dependentes na frequência de mIPSC (0.8 ± 0.1 e 0.9 ± 0.3 Hz, respectivamente), amplitude (53.2 ± 4.0 e 60.7 ± 12.3 pA, respectivamente), tempo de subida (2.5 ± 0.1 e 2.5 ± 0.1 ms, respectivamente), ou tempo de decaimento (5.5 ± 0.6 e 6.2 ± 0.8 ms, respectivamente). A ocitocina não alterou a frequência, amplitude ou cinética de mIPSC para neurônios de ratos não dependentes ou dependentes (Fig 5B), sugerindo não haver efeito da ocitocina nesta forma de liberação de GABA na subdivisão medial do CeA.
A ocitocina bloqueia os efeitos do álcool na liberação de GABA em ratos dependentes
Em seguida, examinamos a interação de oxitocina e álcool agudo em sIPSCs CeA em ratos não dependentes e dependentes. Em 8 dos 12 neurônios CeA de ratos não dependentes que receberam 500 nM de ocitocina e 7 dos 9 neurônios de ratos dependentes, coaplicamos álcool (44 mM) e comparamos os efeitos entre os grupos nas medidas de sIPSC (Figura 5D-5G). Uma ANOVA de duas vias (Grupo × Tratamento) produziu um efeito significativo do Tratamento (F1,13 = 4.87, p < 0.05) e uma interação Grupo × Tratamento (F1,13 = 9.84, p < 0.01) para frequência sIPSC (Fig 5D). As comparações post hoc de Bonferroni indicaram que o álcool com ocitocina aumentou significativamente a frequência de sIPSC em comparação com a ocitocina sozinha em ratos não dependentes.t13 = 3.91, p < 0.01). Portanto, a oxitocina bloqueou o aumento induzido pelo álcool na liberação de GABA apenas em neurônios CeA de ratos dependentes de álcool. Além disso, uma ANOVA de duas vias (Grupo × Tratamento) produziu uma interação significativa Grupo × Tratamento (F1,13 = 20.88, p < 0.001) para o tempo de decaimento de sIPSC (Fig 5G). As comparações post hoc de Bonferroni indicaram que o álcool com oxitocina aumentou significativamente os tempos de decaimento em comparação com a oxitocina sozinha em ratos não dependentes.t13 = 4.86, p <0.001).
Como mostrado anteriormente [52], descobrimos que em ratos não dependentes e dependentes, o álcool agudo sozinho aumentou significativamente a frequência de sIPSC para 145.5% ± 13.4% da linha de base (t5 = 3.40, p < 0.05) e 131.4% ± 8.6% da linha de base (t9 = 3.65, p < 0.01), respectivamente (Fig 5H), sem alterações na amplitude ou cinética da sIPSC, sugerindo aumento da liberação de GABA dependente do potencial de ação. Comparamos os efeitos do álcool sozinho com os efeitos do álcool e da ocitocina usando ANOVAs de duas vias (Grupo × Tratamento) para cada medida de sIPSC (Figura 5H–5K). Encontramos um efeito principal significativo do tratamento (F1,27 = 9.00, p < 0.01) e uma interação significativa Grupo × Tratamento (F1,27 = 5.61, p < 0.05) para tempos de subida de sIPSC (Figura 5J). As comparações post hoc de Bonferroni indicaram uma diferença significativa nos efeitos do álcool com ocitocina versus álcool sozinho para neurônios não dependentes.
Finalmente, descobrimos que o antagonista seletivo do receptor de ocitocina desGly-NH2-d(CH2)5[D-Tyr2,Thr4]OVT sozinho não alterou as sIPSCs (S7 Fig), sugerindo não haver atividade basal desses receptores na transmissão GABAérgica espontânea em ratos dependentes. Notavelmente, em neurônios de ratos dependentes, a oxitocina na presença de OTA não teve efeito nas sIPSCs quando comparada à linha de base (Fig 5L e 5M). Em um subconjunto desses neurônios (8 de 11), aplicamos álcool na presença de OTA e ocitocina, resultando em um aumento significativo na frequência de sIPSC.t7 = 3.01, p <0.05; Figura 5M). Encontramos um efeito semelhante da OTA para resgatar o efeito do álcool em eIPSPs de neurônios não dependentes (t7 = 2.70, p <0.05; S8 Fig). Esses resultados confirmam que o antagonismo do receptor de ocitocina bloqueou os efeitos pós-sinápticos da ocitocina e restaurou a facilitação aguda da liberação de GABA induzida pelo álcool no CeA de ratos dependentes de álcool.
Discussão
A ocitocina administrada por via intraperitoneal, intranasal e intracerebroventricular bloqueou a motivação aumentada para o consumo de álcool que se desenvolveu em ratos dependentes de álcool. A ocitocina intraperitoneal e intranasal em determinadas doses bloqueou o aumento do consumo de álcool e a motivação para o álcool em ratos dependentes, sem afetar esses comportamentos em ratos não dependentes. A ocitocina intranasal não interrompeu a locomoção espontânea, comportamento de limpeza, coordenação motora ou consumo de soluções palatáveis doces ou calóricas. A administração central de ocitocina produziu uma redução dependente da dose no consumo de álcool em ratos dependentes, e este efeito foi replicado pela administração central de um agonista do receptor de ocitocina (PF-06655075) que não atravessa a barreira hematoencefálica e, portanto, não difusa para a periferia. No entanto, a administração periférica de PF-06655075 (que se espera que não atinja o cérebro) não teve efeito. Além disso, a administração periférica de um antagonista do receptor de ocitocina que não atravessa a barreira hematoencefálica não reverteu a capacidade da ocitocina intranasal de reduzir o consumo de álcool em ratos dependentes. Juntos, os dados sugerem um mecanismo central para as ações da ocitocina no consumo de álcool. Ex vivo registros eletrofisiológicos indicaram que a oxitocina inibe a transmissão GABAérgica dependente de potencial de ação espontânea em fatias de CeA de ratos dependentes e não dependentes. No entanto, a capacidade da ocitocina de reduzir a atividade GABAérgica da rede evocada de forma dependente da dose estava ausente em fatias de ratos dependentes. Além disso, a oxitocina embotou a facilitação aguda induzida pelo álcool de respostas GABAérgicas evocadas em ratos não dependentes e dependentes, mas bloqueou a facilitação induzida pelo álcool da liberação espontânea de GABA dependente do potencial de ação apenas em fatias de CeA de ratos dependentes de álcool, sugerindo efeitos diferenciais da rede GABA em ratos não dependentes e dependentes produzidos por ocitocina.
A oxitocina sistêmica bloqueou a motivação aumentada para o álcool observada em ratos dependentes, indexada pelo aumento do consumo de álcool e aumento do ponto de interrupção em um teste de PR, em doses que não alteraram o comportamento de ratos não dependentes. Esses achados são consistentes com relatos anteriores de que a ocitocina pode diminuir o consumo de álcool em camundongos e ratos não dependentes.20,21] e que a oxitocina é particularmente eficaz em diminuir a reintegração induzida por estímulo de busca de álcool em ratos pós-dependentes em comparação com ratos não dependentes [17]. Os presentes achados são únicos em vários aspectos de trabalhos anteriores em ratos [17]. Eles demonstram o seguinte: (1) A oxitocina pode reduzir o consumo de álcool e aumentar a motivação para “trabalhar” pelo álcool em ratos atualmente dependentes de álcool. Essa diferença é crítica, pois fornece uma nova indicação do potencial valor terapêutico da ocitocina. O consumo de álcool durante a abstinência aguda (ou seja, atualmente ratos dependentes de álcool) e prolongada (ou seja, busca de álcool em ratos com histórico de dependência de álcool) é proposto para modelar fases e aspectos distintos do transtorno por uso de álcool, com neurocircuitos subjacentes distintos.2]. Os resultados do presente estudo indicam que a ocitocina pode ter o potencial de reduzir o consumo excessivo de álcool no transtorno por uso de álcool moderado a grave. (2) Os efeitos antibebidas da ocitocina em ratos podem ser alcançados por administração intranasal, usando um dispositivo projetado para permitir a administração não invasiva de drogas através da barreira hematoencefálica [XNUMX].53]. (3) A administração intranasal reduziu o consumo de álcool e a motivação para o álcool em ratos dependentes sem causar locomoção inespecífica, higiene, coordenação motora e consumo de soluções não alcoólicas doces ou calóricas palatáveis, sugerindo que os efeitos da ocitocina no consumo de álcool são específicos aos efeitos farmacológicos do álcool . (4) O presente estudo fornece evidências de que os receptores periféricos não contribuíram significativamente para o efeito da ocitocina intranasal. Mais especificamente, a administração intracerebroventricular de uma molécula grande (PF-06655075) que não atravessa a barreira hematoencefálica ou a administração intracerebroventricular de ocitocina reduziu significativamente o consumo de álcool em ratos dependentes. No entanto, PF-06655075 administrado sistemicamente em uma dose correspondente à dose mais alta testada de ocitocina sistêmica (4 vezes a dose suficiente para bloquear o consumo de álcool em ratos dependentes de álcool) não teve efeito. Portanto, o efeito da ocitocina de reduzir o consumo de álcool no presente modelo de dependência de álcool é provavelmente mediado centralmente. Apoiando ainda mais esta hipótese, a aplicação do antagonista não penetrante do cérebro L-371,257 não reverteu a capacidade da ocitocina intranasal de reduzir o consumo de álcool em ratos dependentes de álcool, sugerindo que a administração intranasal de ocitocina reduz o consumo de álcool em ratos dependentes independente da ligação do receptor de ocitocina em a periferia.
Apesar do mecanismo preciso permanecer desconhecido, há evidências acumuladas de que a ocitocina aplicada perifericamente pode atravessar a barreira hematoencefálica em roedores adultos. Como sugerido por outros [22,23], existe provavelmente um mecanismo para o transporte direto de ocitocina aplicada por via intranasal através da barreira hematoencefálica em roedores adultos. Tanaka e colegas aplicaram ocitocina pelas vias intravenosa, intraperitoneal e intranasal em ratos para determinar os níveis periféricos e centrais de ocitocina resultantes de cada via de administração.23]. Os autores usaram os dados de administração intraperitoneal para determinar a quantidade de ocitocina detectada centralmente que pode ser esperada como resultado dos níveis circulantes periféricos. Eles usaram essa informação para explicar a ocitocina detectada centralmente após a administração intranasal que pode ser o resultado da transferência da ocitocina primeiro do epitélio nasal para a circulação periférica e depois para o cérebro. Concluiu-se que, nas condições de administração intranasal, espera-se que >95% da ocitocina detectada no cérebro resulte do transporte direto através da barreira hematoencefálica.22,23]. De fato, a ocitocina detectada no cérebro foi maior após a administração intranasal em comparação com a administração intravenosa ou intraperitoneal, apesar da administração intranasal resultar em concentrações plasmáticas de ocitocina muito mais baixas. Além disso, as concentrações de ocitocina foram especialmente altas no bulbo olfatório após a administração intranasal, sugerindo uma via direta de entrada.23]. Bustion e colegas demonstraram que a oxitocina radiomarcada administrada em camundongos por via intranasal foi detectada em todo o cérebro, ou seja, dissociando a oxitocina deuterada aplicada exogenamente da ocitocina endógena, confirmando assim a entrada direta.24]. Novamente, níveis particularmente elevados foram detectados no bulbo olfatório, sugerindo um ponto de entrada no epitélio nasal.
Embora a administração intraperitoneal de ocitocina tenha diminuído a locomoção em campo aberto e o consumo de uma solução doce não alcoólica e não calórica e uma solução calórica não alcoólica não adoçada, a administração intranasal não diminuiu. Nem a administração de ocitocina intraperitoneal nem intranasal alterou o comportamento de limpeza em campo aberto ou o desempenho na tarefa de rotarod, indicando que o efeito intraperitoneal na locomoção provavelmente não é resultado de coordenação motora alterada. Uma possível explicação para os efeitos inespecíficos da administração de ocitocina intraperitoneal é que essa ocitocina pode ter “efeitos colaterais” que resultam da ligação em locais periféricos (por exemplo, intestino, coração, sistema vascular e/ou nervo vago) que interrompem o comportamento em geral e que foram induzidas após a administração intraperitoneal de ocitocina no presente estudo. Congruente com esse relato é a observação de que a ocitocina intraperitoneal suprimiu o consumo de água durante os testes para o efeito da ocitocina no consumo de álcool. Em contraste, o tratamento com ocitocina não alterou o consumo de água quando administrado por via intranasal, intracerebroventricular ou intranasal em combinação com L-371,257, sugerindo que os “efeitos colaterais” periféricos foram evitados durante esses testes.S2 Fig). A administração intraperitoneal de ocitocina, ao contrário do agonista restrito perifericamente PF-06655075, foi capaz de bloquear o consumo de álcool em ratos dependentes, de forma semelhante à administração intranasal de ocitocina. Embora se espere que a transferência de ocitocina circulante periférica para o compartimento central seja muito limitada, um pico rápido e dramático nas concentrações plasmáticas de ocitocina foi observado após a administração intraperitoneal que pode permitir que concentrações centrais de ocitocina farmacologicamente relevantes sejam alcançadas, especialmente após a aplicação de doses suprafisiológicas de ocitocina, como usado no presente estudo [18,20,22,23,54]. Um estudo recente descobriu que a ocitocina deuterada administrada por via intravenosa foi detectada centralmente em macacos rhesus (ou seja, dissociando a ocitocina marcada exógena da ocitocina endógena, confirmando a transferência direta.55]). Embora a administração intraperitoneal de ocitocina tenha induzido alguns efeitos colaterais no presente estudo, a ação da ocitocina intraperitoneal que causa redução do consumo de álcool em ratos dependentes é provavelmente o mesmo mecanismo central envolvido após a administração intranasal. No entanto, os presentes dados sugerem que a administração por via intranasal em comparação com a via intraperitoneal pode resultar em farmacocinética mais favorável para atingir a exposição central à periférica da ocitocina.22,23].
Para testar ainda mais a hipótese da ação central da ocitocina, demonstramos que a infusão intracerebroventricular de ocitocina e PF-06655075 (que se espera não difundir para a periferia) reduziu o consumo de álcool em ratos dependentes. A administração sistêmica de PF-06655075 (que se espera que não atravesse a barreira hematoencefálica) não afetou a ingestão de álcool em ratos dependentes. Finalmente, o antagonista do receptor de oxitocina restringido perifericamente L-371,257 não alterou os efeitos da oxitocina intranasal na redução do consumo de álcool em ratos dependentes. Juntos, esses dados sugerem que os receptores periféricos têm uma contribuição mínima para os efeitos da ocitocina intranasal no consumo de álcool.
Em seguida, examinamos os efeitos da ocitocina na transmissão GABAérgica no CeA, uma região-chave do cérebro de desregulação na dependência de álcool.3,56-59]. Para obter uma visão mecanicista sobre a contribuição do sistema de ocitocina na transmissão GABAérgica CeA no contexto do álcool agudo e crônico, aqui, examinamos a transmissão GABAérgica espontânea dependente do potencial de ação e evocada em que a atividade da rede está intacta, bem como a ação -transmissão independente de potencial. Descobrimos que a ocitocina diminui a sinalização de GABA no CeA de ratos dependentes e não dependentes, mas seus efeitos variaram entre os diferentes modos de transmissão GABAérgica. Em ratos não dependentes de álcool, a ocitocina diminuiu as respostas evocadas de GABA pela diminuição da liberação evocada de GABA, um efeito que não é mais observado em ratos dependentes, sugerindo neuroadaptações do sistema de ocitocina CeA na dependência. Em contraste, a ocitocina diminuiu o GABAA função do receptor em ratos não dependentes e dependentes. Semelhante a estudos anteriores na subdivisão medial da CeA [48], a ocitocina não afetou a transmissão GABAérgica independente do potencial de ação em nenhum dos grupos. As respostas evocadas de GABA são geradas pela entrega de uma estimulação elétrica controlada localmente dentro do CeA, enquanto os eventos espontâneos refletem a sinalização inibitória em toda a rede sináptica CeA mais ampla. As correntes em miniatura resultam da fusão espontânea da vesícula pré-sináptica independente da entrada de sódio e determinam mais precisamente os efeitos pré e pós-sinápticos das drogas que ocorrem nos terminais. Além disso, formas espontâneas e evocadas de transmissão de GABA podem representar formas distintas de transmissão de GABA, resultantes de mecanismos distintos de liberação de neurotransmissores pré-sinápticos (por exemplo, maquinaria de fusão de vesículas, segregação espacial das vesículas e/ou populações de vesículas, dinâmica do pool de vesículas sinápticas) [51]. É importante notar que a oxitocina não teve efeito nas mIPSCs ou na excitabilidade celular, portanto, seus efeitos na amplitude e no tempo de subida da sIPSC, bem como na amplitude e na PPR de eIPSP, sugerem efeitos sinápticos em vez de excitabilidade celular. Esses efeitos sinápticos provavelmente ocorrem a montante dentro da rede GABAérgica intacta local que é compartilhada por formas espontâneas e evocadas de transmissão sináptica, enquanto os efeitos em miniatura são mais localizados nos terminais específicos na subdivisão medial do CeA, onde os receptores de ocitocina podem não estar presentes.48]. Essas considerações são críticas e precisam ser levadas em consideração ao comparar com os efeitos eletrofisiológicos da ocitocina relatados por outros na subdivisão lateral do CeA [48,60,61]. Em contraste, esses estudos laterais de CeA relataram efeitos da oxitocina no aumento da excitabilidade de neurônios GABAérgicos CeA laterais que se projetam para o CeA medial, resultando em um aumento na frequência de sIPSC e diminuição da excitabilidade no CeA medial.48]. Embora a ausência de efeito da ocitocina nas mIPSCs no CeA medial seja consistente com nossos resultados, observamos que a ocitocina diminuiu a transmissão GABAérgica no CeA medial sem alterar a excitabilidade celular. Há duas razões prováveis para essas discrepâncias. O primeiro é o uso do peptídeo nativo oxitocina em nossos estudos em oposição ao agonista do receptor peptídeo oxitocina seletivo (Thr⁴,Gly⁷)-Ocitocina (TGOT) [34]. Embora bloqueiemos farmacologicamente o receptor de vasopressina predominante no CeA, agonistas peptídicos nativos versus seletivos para o receptor de ocitocina podem exibir seletividade funcional no receptor de ocitocina ou efeitos fora do alvo. A segunda possibilidade é a heterogeneidade e interconectividade dos neurônios GABAérgicos no CeA. O CeA medial contém neurônios GABAérgicos que se projetam para fora do CeA, bem como fazem sinapse localmente. Em um estudo anterior [48] das células responsivas ao TGOT, apenas cerca de metade dos neurônios inibidos pelo TGOT foram excitados pela vasopressina. Além disso, Viviani e colegas relataram que as populações específicas de projeção de neurônios GABAérgicos CeA mediais não responderam ao TGOT.60]. Portanto, é possível que a maioria dos neurônios dos quais registramos fosse de uma subpopulação de neurônios GABA que não receberam inervação direta de neurônios GABAérgicos CeA laterais excitados por ocitocina. Além disso, de nossos experimentos evocados, a estimulação elétrica provavelmente excitou neurônios no CeA lateral e medial, e nossas respostas foram uma composição desses efeitos. Portanto, experimentos futuros determinarão tipos específicos de células para entender os distintos efeitos da ocitocina nos diferentes componentes da rede sináptica.
Compreender as ações fisiológicas da ocitocina no CeA pode se beneficiar em comparação com os efeitos pró-estresse e pró-bebimento do fator liberador de corticotropina (CRF) e os efeitos anti-estresse e anti-bebimento do neuropeptídeo Y (NPY). O neuropeptídeo pró-estresse CRF está elevado no CeA, provavelmente mediado por receptores de glicocorticóides.62,63] na dependência de álcool e infusão de CRF1 ou antagonistas de receptores de glicocorticóides no CeA suprimem o consumo de álcool especificamente em ratos dependentes de álcool [38,62,64-66]. Em contraste, o neuropeptídeo antiestresse NPY está diminuído no CeA na dependência de álcool, e a infusão intra-CeA de NPY suprime o consumo de álcool especificamente em ratos dependentes.67,68]. Relatamos que o CRF, semelhante ao álcool, aumenta de forma robusta a transmissão GABAérgica em CeA de ratos.38,66,68]. No entanto, o NPY e a nociceptina diminuíram a liberação pré-sináptica de GABA no CeA, normalizando a transmissão GABAérgica aumentada observada na dependência de álcool.68]. Tanto o NPY quanto a nociceptina também bloqueiam a facilitação pré-sináptica aguda induzida pelo álcool da liberação de CeA GABA, enquanto a oxitocina bloqueou a liberação de GABA apenas em ratos dependentes. Relatamos anteriormente que o álcool pode agir pré-sinapticamente através de canais de cálcio dependentes de voltagem para aumentar a liberação de GABA dependente do potencial de ação no CeA e que a dependência do álcool interrompe esse mecanismo, mudando as ações do álcool para o CRF1 receptores [52]. Isso pode explicar por que a ocitocina não tem efeito sobre eIPSPs em animais dependentes se a dependência do álcool desregula os canais de cálcio e os efeitos da ocitocina funcionam através de mecanismos dependentes de cálcio induzidos pelo potencial de ação. Além disso, a ocitocina, por meio da ação nos receptores de ocitocina, pode interferir no CRF1 mecanismo mediado por receptor em ratos dependentes para atenuar os efeitos do álcool. Portanto, as ações da ocitocina no CeA são semelhantes, mas não idênticas, aos neuropeptídeos antiestresse como o NPY.67]. As ações da ocitocina são particularmente complexas dadas as interações pré e pós-sinápticas com o álcool. Estudos futuros serão necessários para investigar o papel funcional da ocitocina em suas interações com outros sistemas pró-estresse e anti-estresse no CeA.
Uma limitação importante do presente trabalho é que os estudos foram conduzidos exclusivamente em ratos machos, especialmente considerando a distribuição de ocitocina sexo-específica e a mediação comportamental.69,70] e diferenças sexuais no consumo de álcool [35,71]. Será fundamental testar o efeito da ocitocina em mulheres para determinar até que ponto as presentes conclusões podem ser generalizadas para mulheres. Em segundo lugar, os experimentos de comportamento e eletrofisiologia foram realizados em ratos Wistar e Sprague Dawley, respectivamente. Observe que, em geral, achamos que as diferentes linhagens de ratos são mais adequadas para um conjunto de experimentos ou outro (Wistar para comportamento e Sprague-Dawley para eletrofisiologia). Pode haver diferenças de cepa na sensibilidade de ratos ao tratamento com ocitocina (por exemplo, MacFadyen e colegas relataram que 0.1 mg/kg de ocitocina reduziu o consumo em ratos Sprague-Dawley não dependentes [18]). No entanto, incluímos controles internos em experimentos comportamentais e eletrofisiológicos e mostramos anteriormente que a atividade sináptica de CeA basal e os efeitos das drogas são semelhantes entre essas cepas.72]. Como tal, não encontramos problemas para vincular conceitualmente os conjuntos de dados. Por fim, embora tenhamos testado os efeitos da ocitocina na sinalização CeA GABAérgica na presença de um antagonista V1a para descartar a contribuição dos receptores CeA vasopressina nos efeitos da ocitocina na sinalização CeA GABAérgica, a contribuição dos receptores vasopressina para os efeitos comportamentais observados não foi avaliada em o presente estudo. Há evidências sugerindo um papel dos receptores centrais da vasopressina em comportamentos sociais e agressivos e estados afetivos, incluindo comportamento semelhante à ansiedade.54]. Esperaríamos que o agonismo desses receptores pela oxitocina tivesse efeitos pró-estresse e pró-beber, em vez de contribuir para uma redução no consumo de álcool em ratos dependentes neste modelo. Consistente com essa hipótese, Edwards e colegas relataram que o antagonismo de V1b em ratos dependentes diminuiu o consumo de álcool [XNUMX].73]. Efeitos semelhantes também foram relatados em ratos da Sardenha que preferem o álcool.74] e humanos dependentes de álcool [75].
Em resumo, o presente estudo relata que a ocitocina via ação central e não periférica reduziu o consumo de álcool e a motivação para o álcool em um modelo animal de dependência de álcool. Esses efeitos podem resultar de alterações induzidas pela dependência nos sistemas de oxitocina e GABA em regiões extra-hipotalâmicas do cérebro relacionadas à recompensa e ao estresse, como a amígdala estendida. A administração intranasal de ocitocina parece ser vantajosa em termos de especificidade na redução do comportamento motivado pelo álcool em comparação com a administração intraperitoneal. Portanto, o presente trabalho destaca o sistema de ocitocina como alvo para a compreensão da plasticidade do estresse cerebral e dos sistemas antiestresse na etiologia dos transtornos por uso de álcool. O direcionamento desse sistema, possivelmente por administração intranasal, pode fornecer novas intervenções farmacêuticas para o tratamento do transtorno por uso de álcool.
S1 Fig. Resposta/reforço operante de linha de base (FR1) para álcool a 10% (p/v) e água antes do teste farmacológico de ocitocina intraperitoneal e intranasal.
(A) Últimas 8 sessões de treinamento de autoadministração de álcool operante (FR1) antes do teste intraperitoneal. Uma RM ANOVA de 2 × 8 (Grupo × Sessão) confirmou um efeito significativo do Grupo (F1,18 = 53.14, p < 0.0001). Um efeito significativo da Sessão (F7, 126 = 2.14, p < 0.05) também foi detectado, indicando um aumento no consumo de álcool entre as sessões. (B) Oito sessões de treinamento de autoadministração de álcool operante foram usadas para restabelecer uma linha de base de consumo de álcool antes do teste intranasal. Uma ANOVA de RM de 2 × 8 (Grupo × Sessão) indicou que a diferença entre ratos dependentes e não dependentes ao longo de 8 sessões foi significativa (F1, 18 = 30.58, p < 0.0001), e houve um efeito principal significativo da sessão como comportamento estabilizado ao longo do tempo (F7, 126 = 3.397, p < 0.01). (C) Resposta/reforço de água durante as 8 sessões anteriores ao teste intraperitoneal. Uma diminuição significativa no consumo de água foi observada ao longo das sessões (F7, 126 = 3.54, p < 0.01). (D) A resposta/reforço da água foi baixa durante as 8 sessões anteriores ao teste intranasal. FR1, razão fixa 1; RM ANOVA, ANOVA de medidas repetidas.
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S2 Fig. Resposta/reforço na alavanca de água durante os testes farmacológicos.
A resposta à água permaneceu baixa em relação à resposta/reforço ao álcool em todos os testes farmacológicos. (A) A ocitocina diminuiu a resposta/reforço da água após a administração intraperitoneal, independentemente do grupo (F4, 72 = 4.32, p < 0.01). Análises post hoc indicaram que a resposta à água foi significativamente reduzida nas doses de 0.5 mg/kg e 1 mg/kg (p < 0.01). (B) A resposta/reforço da água não foi alterada durante o tratamento com ocitocina intranasal em nenhum dos grupos. (C) O consumo médio de água não foi alterado significativamente durante os testes de administração de ocitocina icv. (D) A resposta/reforço da água não foi alterada em ratos dependentes durante os testes de ocitocina intranasal combinada com o antagonista restringido perifericamente L-371,257. (E) A administração intracerebroventricular de PF-06655075 reduziu significativamente o consumo de água em comparação com a linha de base (F2, 12 = 4.098, p < 0.05, teste post hoc: p < 0.05), mas não comparado com o veículo. (F) A administração sistêmica de PF-06655075 reduziu significativamente o consumo de água em relação à linha de base (F2, 16 = 3.948, p < 0.05, teste post hoc: p < 0.05), enquanto seu veículo não. icv, intracerebroventricular.
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S3 Fig. Efeito da ocitocina na frequência de picos.
Frequência de pico em 2 correntes injetadas sob condições de linha de base para neurônios de não dependentes (200 pA: 1.55 ± 0.46 picos, 400 pA: 4.18 ± 0.57 picos) e dependentes de álcool (200 pA: 2.47 ± 0.55 picos, 400 pA: 4.73 ± 0.91 picos ) ratos. A ocitocina (500 nM) não alterou a frequência de pico em nenhum nível de corrente para não dependente (200 pA: 1.91 ± 0.46 picos, 400 pA: 4.91 ± 0.58 picos) ou dependente (200 pA: 1.87 ± 0.73 picos, 400 pA: 4.87 ± 1.10 espigas) neurônios.
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S4 Fig. Relação de amplitude da linha de base de E/S eIPSP para animais não dependentes e dependentes de álcool.
Curvas de E/S eIPSP geradas por 5 intensidades de estímulo normalizadas equivalentes entre não dependentes (3.7 ± 0.3, 7.0 ± 0.6, 9.7 ± 0.7, 12.2 ± 0.8 e 14.7 ± 0.9 mV) e dependentes (3.7 ± 0.3, 6.8 ± 0.5, 9.9 ± 0.7, 12.8 ± 0.8 e 14.9 ± 0.9 mV). eIPSP, potencial pós-sináptico inibitório evocado; E/S, entrada-saída.
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S5 Fig. Efeito do álcool e TMA em eIPSPs.
O álcool (44 mM) aumentou as respostas evocadas de GABA em neurônios de ratos não dependentes e dependentes, um efeito não afetado pelo antagonista do receptor de vasopressina 1A TMA. eIPSP, potencial pós-sináptico inibitório evocado; TMA, (d(CH2)5,Tyr(Me)2,Arg8)-Vasopressina.
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S6 Fig. Efeito de TMA em sIPSCs.
Linha de base GABAAAs medições de frequência, amplitude e cinética de sIPSC mediadas (tempo de subida e descida) não são afetadas pela aplicação do antagonista do receptor de vasopressina 1A (TMA) em neurônios CeA de ratos não dependentes e dependentes de álcool. CeA, núcleo central da amígdala; sIPSC, corrente pós-sináptica inibitória espontânea; TMA, (d(CH2)5,Tyr(Me)2,Arg8)-Vasopressina.
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S7 Fig. Efeito da OTA em sIPSCs.
O antagonista do receptor de ocitocina OTA não afetou a frequência, amplitude ou cinética de sIPSC em neurônios CeA de animais dependentes. CeA, núcleo central da amígdala; OTA, desGly-NH2-d(CH2)5[D-Tyr2,Thr4]OVT; sIPSC, corrente pós-sináptica inibitória espontânea.
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S8 Fig. Efeito da OTA nos eIPSPs.
O antagonista do receptor de ocitocina OTA não afetou a amplitude de eIPSP, mas bloqueou as diminuições induzidas pela ocitocina na amplitude e restaurou os aumentos induzidos pelo etanol na amplitude em neurônios CeA de animais não dependentes. CeA, núcleo central da amígdala; eIPSP, potencial pós-sináptico inibitório evocado; OTA, desGly-NH2-d(CH2)5[D-Tyr2,Thr4]OVT.
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Texto S1. Este arquivo contém métodos e resultados complementares.
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