Delade och unika mönster över kladdarna.

Inom varje kladd jämförde vi uttryck av ortologa gengrupper (OGG) mellan artpar (SI-bilaga, Fig S3). Vi fann att medelskillnaden i uttryck mellan artpar var nära noll över alla 1,979 XNUMX OGGs (SI-bilaga, Fig S3A). Intressant nog var genuttrycket minst varierande mellan de två fågelarterna (SI-bilaga, Fig S3B), vilket kan förklaras av det faktum att parningssystemen för dessa artpar är avsevärt mer lika än de hos de andra kladerna (Fig 2). Närmare bestämt båda Anthus spinoletta och Prunella modularis kan bilda parbindningar (även om mer sällan i P. modularis) och uppvisar direkt faderlig omsorg (Fig 2 och SI-bilaga, Fig. S1 och Tabell S1). Trots dessa skillnader i OGG-uttrycksvariation mellan klader, avslöjade clade-specifik Gene Ontology (GO) analys hög bevarande av GO-termberikning som lyfte fram cellkommunikation, signalerande receptoraktivitet och membranproteiner som konsekvent associerade med monogami-relaterat uttryck över clades (SI-bilaga, Fig S4).

Över ryggradsdjur varierar genuttrycket överensstämmande mellan hanar av monogama och icke-monogama arter.

För att bedöma överensstämmelse mellan OGG-uttrycksvariation mellan monogama och icke-monogama arter över ryggradsdjursklader, använde vi programpaketet för differentiell uttrycksanalys DESeq2 (33). Vi bedömde differentiellt OGG-uttryck flera gånger med distinkta evolutionära grupperingar från däggdjur till alla klader där monogama arter av distinkta klader skrevs in som interspecifika replikat av monogami (Fig 3). Vi finner att skillnader i OGG-uttryck generellt är överensstämmande, särskilt bland OGG:er som uppvisar större veck-skillnader (Fig 3). Dessutom upprätthåller de flesta OGG:er riktningsöverensstämmelse. Till exempel, många av OGG:erna som visar ökat uttryck (positiv log₂ gångerskillnad) i en evolutionär grupp (t.ex. däggdjur) visar ökat uttryck i andra evolutionära grupper (Fig 3). Dessa resultat indikerar att monogama arter över ryggradsdjur rekryterar en gemensam uppsättning OGG trots evolutionärt oberoende övergångar till liknande parningssystem. Vi finner att när den evolutionära referensramen utökas och mer avlägset besläktade klader läggs till i analysen, behåller färre OGGs betydelse. Speciellt finner vi en stor minskning av OGG:er över tröskeln när amniot-artpar (dvs. par av däggdjur och fågelarter) ingår jämfört med endast paren av däggdjursarter (Fig 3). Detta fynd återspeglar sannolikt den minskade uttrycksvariationen som är anmärkningsvärd i vårt fågelartspar (SI-bilaga, Fig S3). Medan den observerade effekten av parningssystemet för vissa OGG kan vara mindre på bredare taxonomiska skalor, ökar den statistiska kraften genom att lägga till artpar. Sålunda, med undantag för jämförelsen mellan däggdjur och fåglar som beskrivs ovan, är minskningen av antalet OGG:er som möter vår tröskelgräns ganska liten (Fig 3).

När vi inkluderade alla artpar identifierade vi 123 OGG (6.2%) associerade med monogami över ryggradsdjur (SI-bilaga, Fig S5). Vi finner att ett antal OGG är signifikanta på en analysnivå som inte når signifikanströskeln på en annan (Fig 3). Många metoder för differentiell uttrycksanalys, inklusive DESeq2, förlitar sig på uttrycksvariation bland biologiska replikat för att bestämma differentiellt uttryck. Detta tillvägagångssätt är begränsande när biologiska replikat är mycket varierande (34) som är fallet här, där arter av olika klader ingår som interspecifika replikat av monogami. Förutom evolutionärt avstånd, genererar ett antal biologiska och tekniska egenskaper sannolikt brus i vår analys (t.ex. ekologiska skillnader mellan arter, provtagning av vävnadsprov och teknisk variation under sekvensering). För att identifiera delade transkriptomiska mönster över monogama arter och bedöma om graden av överlappning i uttryck mellan monogama arter är statistiskt signifikant, använder vi tillvägagångssättet Rank-Rank Hypergeometric Overlap (RRHO) (34). Att jämföra rankade veck-skillnader möjliggör upptäckt av OGG:er som delar uttrycksmönster bland monogama arter utan att kräva att uttrycksvärdena är liknande över evolutionärt avlägsna klader. Dessutom, snarare än att hålla sig till diskreta trösklar för att identifiera kandidater med liknande uttryck, identifierar RRHO kandidater med koordinerade riktningsförskjutningar i uttryck med hjälp av en glidande tröskel (34) (Fig 4).

Genom att använda RRHO inklusive alla 1,979 XNUMX OGG, finner vi en anrikning av OGG-överlappning i de på diagonala extremerna (dvs. vid hög log₂ veck-skillnader i uttryck mellan monogama och icke-monogama arter i båda kladerna som jämförs; Fig 4D). Mest anmärkningsvärt finner vi berikad överlappning av OGGs som uppvisar minskat uttryck i monogama arter av alla klader. I alla jämförelser har den överensstämmande nedreglerade (dvs. längst ner till vänster) kvadranten av RRHO-plotterna den största övergripande signifikansen (dvs. mest signifikanta kvadrantmedelvärde −log₁₀ P värde), som starkt indikerar en universell signatur för uttryck bland monogama ryggradsdjur (Fig 4 C och D). Vi finner i allmänhet ingen anrikning vid små stockar₂ veck-skillnader med några få undantag (t.ex. grodor och sorkar). Denna observation beror sannolikt på det faktum att majoriteten av OGGs uppvisar små veckskillnader (även om de kan vara viktiga för monogami-relaterat beteende). Subtil variation i uttryck av gener involverade i clade-specifika eller grundläggande cellulära funktioner kan maskera potentiellt viktiga likheter på denna nivå. En konsekvens av denna begränsning av RRHO-metoden är att, för OGG:er med små veckningsskillnader, krävs en stor överlappning av OGG:er för att uppnå betydande anrikning. Intressant nog uppvisar clade-jämförelser inklusive grodor mest anrikning i de off-diagonala (dvs disharmoniska) regionerna. Specifikt ökar många ortologa gengrupper som visar minskat uttryck i andra grupper i de monogama grodorna, ett fynd som överensstämmer med den allmänna trenden med ökat genuttryck i de monogama grodorna (SI-bilaga, Fig S3A). Detta mönster är tydligt i alla parvisa jämförelser som involverar grodor, vilket tyder på att de monogamirelaterade uttrycksmönstren i grodor är minst lika de andra kladerna. Jämförelser inklusive fåglar visar minst anrikning i OGG-överlappning, möjligen på grund av att parningssystemen för fågelarterna i vår studie är relativt lika varandra, som diskuterats ovan. Viktigt är dock att fåglar fortfarande delar samma övergripande mönster av OGG-överlappning i de on-diagonala extremerna och visar starka likheter i uttrycksmönster i OGG med högt differentiellt uttryck (t.ex. Nedre vänstra och Överst till höger kvadranter av fåglar vs. möss och fåglar vs. fiskar, Fig 4D). Variation mellan klader i övergripande och specifika mönster av OGG-berikning kan återspegla en skillnad mellan klader i artspecifika egenskaper hos monogami. Till exempel, manlig föräldravård är urfader i giftgrodkladden (35). Sålunda utvecklades biparental vård förknippad med monogami hos våra fokala arter från manlig vård i vår grodklade snarare än från kvinnlig vård som i de andra kläderna som undersökts här. Framtida analyser - inklusive arter som uppvisar vissa men inte alla reproduktiva, föräldra- och agonistiska fenotyper av monogami samt en mer anatomiskt fokuserad analys - kan kasta ljus över denna variation, vilket möjliggör frikoppling och association av genuttrycksmönster med mer specifika beteendefenotyper.

Upptäckt av kandidater som ligger bakom monogami.

Vi identifierade 24 kandidatgener som är robusta (dvs oberoende i både differentiellt uttryck och RRHO-analyser) associerade med monogama parningssystem över ryggradsdjur (Fig 5, SI-bilaga, Tabell S7 och Dataset S1). Intressant nog, över linjer, gener involverade i neural utveckling, cell-cell-signalering, synaptisk aktivitet (t.ex. GRM6), inlärning och minne (t.ex. DSCAM) och kognitiv funktion uppregleras hos monogama män. Omvänt nedregleras gener involverade i gentranskription (t.ex. gener associerade med RNA-polymeras II) och AMPA-receptorreglering. Dessa skillnader kan tyda på ökad neural plasticitet inför stramare transkriptionsreglering hos monogama män. En mer detaljerad diskussion om dessa kandidatgener, inklusive en beskrivning av neurolokalisering, ges i SI-bilaga, Tabell S7 och Dataset S1. Medan majoriteten av kandidat-OGGs som identifierats av båda metoderna för differentiell uttrycksanalys (DESeq2 och RRHO) visar ökat uttryck hos monogama män, sker den största överlappningsberikningen i OGG med minskat uttryck hos monogama män (Fig 4). Många av dessa OGG:er överlever inte tröskelberoende DESeq2-analys och elimineras därför från vår lista över robusta kandidater. Traditionella kandidater associerade med monogami-relaterat beteende (t.ex. AVP och OT såväl som deras receptorer) identifierades inte bland de som konsekvent uttrycks i monogama män, och i vissa arter identifierades inte i RNA-seq-analysen (SI-bilaga, Fig S6). Detta fynd tyder inte på att dessa traditionella kandidater är oviktiga för att reglera monogami-relaterat beteende över dessa klader, utan snarare att deras roller (om de bevaras över monogama arter) inte återspeglas i ett konsekvent uttrycksmönster på den grova neuroanatomiska skalan som vi provades.

Fylogenetiska och ekologiska korrelat.

Den kombinerade upptäckten av monogami-relaterat OGG-uttryck genom differentiell uttrycksanalys (Fig 3) och anrikning av genuttryckets rangkorrelation bland kladerna (Fig 4) stöder hypotesen att delade genuttrycksmönster ligger till grund för beteendeuttrycket av monogama parningssystem över ryggradsdjur. Det är dock möjligt att historiska och ekologiska egenskaper som delas mellan kladerna påverkar likheten i neurala genuttrycksmönster. Genom designen var artpar ganska lika i sina ekologiska egenskaper, och skilde sig främst i specifika egenskaper hos deras parningssystem (Fig 2 och SI-bilaga, Fig. S1 och tabellerna S1 och S2). Således bör urvalet av artpar efter klädsel minimera förvirrande ekologiska faktorer; emellertid kan flera andra faktorer spela en roll i genuttryckslikheten. För det första varierar divergenstider mellan artpar mellan ~2.5 och 34 miljoner år (36). Historiska oförutsedda händelser kan påverka evolutionens väg så att mer närbesläktade arter kan vara mer lika på grund av delad evolutionär historia. För det andra varierar utarbetandet av parningssystem mellan arter så att jämförelser mellan monogama och icke-monogama parningssystem inte är likvärdiga över kladden. Till exempel delar fågelarterna som ingår i denna studie ett antal parningssystemets egenskaper (Fig 2). För att bedöma rollen av evolutionär historia och parningssystem på genuttrycksdivergens jämförde vi evolutionära och parningssystemavstånd med OGG-uttrycksavstånd för alla artpar. Varken evolutionärt avstånd eller parningssystemavstånd korrelerade med OGG-uttrycksdivergens mellan artpar (Fig 6 A och B). Noterbart finner vi dock att fåglarna och grodorna är mest lika i sina respektive transkriptom och är också de mest lika i egenskaper hos parningssystemet, samtidigt som de är de mest avlägset besläktade av alla artpar (fåglar: 29 Mya; grodor: 34.2 Mya; Fig 1 och SI-bilaga, Fig S3). När expressions- och parningssystemets variation hänförlig till fylogeni avlägsnas (med användning av fylogenetiskt oberoende kontraster), finner vi ett signifikant samband mellan neuralt genuttryck och parningssystem (Fig 6C). Även om fylogenetisk släktskap och ekologiska attribut påverkar neurala transkriptomlikheter över arter på komplexa sätt, indikerar dessa observationer tillsammans en avgörande roll för parningssystemet för att driva genuttryckslikhet i hjärnan.

• Ladda ner bild
• Öppna i ny flik
• Ladda ner powerpoint

Fig. 1.

Representativa arter som uppvisar monogama parningssystem (inklusive att bilda parbindningar, engagera sig i biparental vård och försvara territorium) inkluderades i analysen. För att minska clade-specifika genuttrycksmönster och identifiera neurala uttrycksmönster associerade med ett monogamt parningssystem parades monogama arter med en närbesläktad icke-monogam art. Monogama arter för varje kladd visas i orange och icke-monogama visas i lila. Gener grupperades i OGGs med hjälp av orthoMCL (44). Av de 6,125 XNUMX OGG som identifierats över kladerna visas antalet OGG och gener inom parentes med uttrycksdata vid varje spets (SI-bilaga, Tabell S3). Antalet delade OGG och gener inom parentes (för artpar) vid varje nod visas. Median divergensuppskattning erhölls från TimeTree (SI-bilaga, Tabell S5) (46). Streckade grenlängder är inte skalenliga.

• Ladda ner bild
• Öppna i ny flik
• Ladda ner powerpoint

Fig. 2.

Parningssystem och ekologiska avstånd mellan fokala monogama och icke-monogama artpar. Divergens mellan artpar indikeras av färgintensitet. Orange indikerar karaktärstillstånd som är uttryckta (eller mer utarbetade) hos den monogama arten. Lila karaktärer är uttryckta (eller mer utarbetade) i den icke-monogama arten. Vit indikerar att karaktärstillståndet är likartat i artparet. Profiler för alla arter i denna studie tillhandahålls i SI-bilaga, Fig. S1 och tabellerna S1 och S2.

• Ladda ner bild
• Öppna i ny flik
• Ladda ner powerpoint

Fig. 3.

Vulkanplottar som indikerar vilka av de 1,979 2 OGG som identifierats över alla klader som uttrycks differentiellt på olika taxonomiska nivåer (endast däggdjur, däggdjur och fåglar, tetrapoder, alla klader). Differentiell expressionsanalys utfördes med användning av DESeq399, där de monogama (icke-monogama) arterna av varje kladd inkluderades som interspecifika replikat av monogami (icke-monogami). Svarta cirklar visar inget differentiellt uttryck på någon taxonomisk nivå. Differentialexpressionsanalys utfördes på distinkta evolutionära undergrupper: endast däggdjur (155 OGGs reglerade i överensstämmelse), däggdjur och fåglar (126 OGGs), tetrapoder (dvs. inklusive grodor; 123 OGGs) och alla fyra kladdarna av ryggradsdjur (dvs. inklusive fiskar; XNUMX OGG). OGGs med en –logg₁₀ P värde > 1 och en logg₂ vikningsskillnaden mindre än -1 (blå) respektive större än 1 (röd) är markerade. Ju mörkare varje cirkel, desto mer överensstämmande över kladden är uttrycket för OGG som den representerar. När fler linjer läggs till i analysen, faller fler OGG:er som är signifikanta i en analys under signifikanströskeln i en annan; lägga till artpar ökar emellertid den statistiska kraften på grund av det ökade antalet interspecifika replikat; sålunda, med undantag för enbart evolutionära undergruppsdäggdjur jämfört med däggdjur och fåglar, är minskningen av antalet OGGs som möter vår tröskelgräns liten.

• Ladda ner bild
• Öppna i ny flik
• Ladda ner powerpoint

Fig. 4.

RRHO av monogami-relaterad logg₂ gångerskillnader i genuttryck för de 1,979 XNUMX OGG som identifierats över alla klader. Rangordnad logg₂ vecklingsskillnader i monogama kontra icke-monogama mRNA-nivåer lagras i 44 uppsättningar av 45 OGGs från de mest nedreglerade till de mest uppreglerade i de monogama arterna av varje kladd. OGG-uppsättningsöverlappning jämförs i fyra kvadranter definierade av övergången mellan ned- och uppreglering i varje kladd (A, Streckade linjer). Färgen på varje pixel i matrisen (A, röd fyrkant) indikerar anrikningen i OGG-uppsättningens överlappning vid och över det differentiella uttryckströskeln (B) och uttrycks som den negativa loggen₁₀ av Benjamini–Yekutieli-korrigerade P värde. Betydelsen av anrikningen indikeras av pixelfärgen med varma färger som indikerar ökad anrikning. För varje parvis jämförelse av klader sammanfattas styrkan hos OGG-uppsättningsöverlappningen som den mest signifikanta kvadrantmedelvärdet för negativa log₁₀ av den BY-korrigerade (C). Medelvärde, median och maximum P värden för varje kvadrant finns i SI-bilaga, Tabell S6. Pilar bredvid siluetterna indikerar riktningen i linje A (första) och linje B (andra) (C). RRHO-analyser visas för varje parvis clade-jämförelse (D). Negativ logg₁₀ av den BY-korrigerade P värde färgskala varierar mellan plotter. Streckade linjer indikerar läget för växlingspunkten från ned- till uppreglering i de monogama arterna i varje kladd. Pilar på färgskalan anger färgen vid P värde = 0.05.

• Ladda ner bild
• Öppna i ny flik
• Ladda ner powerpoint

Fig. 5.

Upptäckt av monogami kandidatgener (OGGs). För att säkerställa ett rigoröst och konservativt tillvägagångssätt för att identifiera OGGs som är robust associerade med monogami över klader, var varje given gen/OGG tvungen att uppfylla två urvalskriterier. Först måste en OGG visa en ±1 log₂ gånger uttrycksskillnad mellan de monogama och icke-monogama arterna i minst fyra klader. För det andra måste en OGG vara bland de mest upp- eller mest nedreglerade i 6 av de 10 RRHO-analyserna (som visas i Fig 4); detta krävde återigen att en OGG skulle uttryckas överensstämmande i åtminstone fyra av de fem linjerna. Vilken klad (om någon) som inte är konkordant kan variera för varje OGG. Relativa uttrycksnivåer för dessa kandidater illustreras i värmekartan. Observera att ingen klad är oftare disharmonisk än någon annan (SI-bilaga, Tabell S7).

• Ladda ner bild
• Öppna i ny flik
• Ladda ner powerpoint

Fig. 6.

Evolutionär divergens (A) och divergens i parningssystemets egenskaper (B) inom kladerna korrelerar inte med genuttrycksavståndet (Spearman ρ = −0.8, P = 0.95; ρ = 0.7, P = 0.12 respektive). Men när uttrycksvariationer på grund av fylogeni tas bort (med fylogenetiskt oberoende kontraster) (C), finner vi ett signifikant samband mellan parningssystem och neuralt genuttryck över klader (linjär regression r² = 0.6, t = 3.8, P = 0.005). Parningssystemets poäng beräknades som summan av parningssystemets egenskaper där högre värden indikerar mer utarbetad monogami (dvs män bildar parbindningar, ger direkt och indirekt föräldravård, uppvisar höga nivåer av territorialitet och är mindre sexuellt dimorfa; Fig 2 och SI-bilaga, Fig. S1 och tabellerna S1 och S2). En huvudkomponentanalys utfördes på de differentiellt uttryckta (±1 log₂ vikskillnad i minst en kladd) och variabel (Övre varianskvartil mellan alla arter) OGGs. Denna delmängd av 401 OGGs användes också för OGG-uttrycksdivergens i A och B. Se SI-bilaga.

Slutsatser.

Med hjälp av en jämförande transkriptomik-metod frågade vi om oberoende övergångar till ett monogamt parningssystem över fyra stora klader av ryggradsdjur är associerade med delade neurala genuttrycksmönster. En delad mekanistisk grund för socialt beteende över avlägset besläktade klader har dokumenterats på nivån av neurala kretsar där hjärnregionspecifikt uttryck av neurokemiska gener är anmärkningsvärt bevarat i det sociala beslutsfattande nätverket för ryggradsdjurens fram- och mellanhjärna (37). Ytterligare neurala genuttrycksjämförelser av aggressivt beteende hos bin, stickleback och möss (4) ger stöd för hypotesen att breda likheter i socialt beteende mellan arter kan vara resultatet av oberoende rekrytering av gamla genmoduler. Men slutsatsen från denna analys begränsades av komplexiteten hos homologi slutledning bland hjärnor i bin och hjärnregioner provtagna i möss och stickleback. Vi utökar denna tidigare jämförande neurala genuttrycksstudie av socialt beteende genom att jämföra ekvivalenta hjärndissektioner och tillhandahålla en fylogenetiskt informerad bedömning av transkriptomlikhet hos monogama arter av distinkta och avlägset besläktade klader. Dessutom, genom att noggrant poängsätta parningssystemets egenskaper och ekologiska attribut och genom att ta hänsyn till fylogenetisk icke-oberoende, testar vi alternativa hypoteser som ligger till grund för ursprunget till transkriptomiska likheter som har sitt ursprung i oberoende evolutionära övergångar till monogami över ryggradsdjur. Medan vår provtagning av hela fram- och mellanhjärnor ger en grovkornig bild av de neuromolekylära korrelaten i parningssystemet, kringgår detta tillvägagångssätt potentiella problem med den ibland svaga homologi slutsatsen av hjärnregioner, vilket säkerställer konsekvent provtagning över klader.

Vår analys avslöjar att monogama arter av avlägset besläktade ryggradsdjur delar fler genuttryckslikheter än vad som skulle förväntas av en slump, särskilt i OGGs som är mycket differentiellt uttryckta i monogama arter. Delat OGG-uttryck över dessa klader ger bevis på djupt homologa mekanismer som ligger till grund för sviten av reproduktiva, föräldra- och agonistiska beteendefenotyper som åtföljer monogama parningssystem. Vår upptäckt lägger till den växande mängden forskning som lyfter fram delade mekanistiska baser för oberoende utvecklade morfologiska och fysiologiska fenotyper (12). Det föreliggande arbetet illustrerar att den oberoende utvecklingen av komplexa beteendefenotyper, som monogami, bättre konceptualiseras som produkten av både parallella och konvergerande processer där många komponenter i den underliggande mekanismen uppstår via parallell rekrytering av djupt delade gennätverk och vissa mekanismer utvecklas de novo (38⇓-40). Vi hävdar att ett konceptuellt skifte är avgörande för att uppnå framsteg mot att testa mekanistiska hypoteser om utvecklingen av komplext socialt beteende med hjälp av jämförande 'omiska tillvägagångssätt (som har föreslagits för morfologiska egenskaper; jfr ref. 41). Eftersom övervikten av bevis stöder forntida, djupt homologa molekylära och utvecklingsvägar i evolutionär diversifiering, bör liknande fenotyper förväntas ha mekanistiska likheter oavsett evolutionärt ursprung. Enligt denna modell förväntas oberoende evolutionära övergångar till liknande beteendefenotyper dela liknande mekanismer som en konsekvens av (i) integration av nya egenskaper med delade, förfäders fysiologiska processer och deras associerade utvecklings- och genetiska vägar; och (ii) liknande utmaningar för grundläggande fysiologi som organismer upplever i utvecklingen av dessa liknande fenotyper. Medan tidigare redogörelser för transkriptomiska likheter mellan evolutionärt distinkta komplexa beteenden har fokuserat på genuttryckslikheter, ger detta konceptuella tillvägagångssätt ett sammanhang för att utnyttja både likheter och skillnader i genuttryck för att förstå den mekanistiska grunden för komplexa egenskapers evolution. Sammantaget indikerar våra resultat att oberoende evolutionära övergångar till ett monogamt parningssystem över ryggradsdjursklader åtföljs av liknande förändringar i genuttryck i den manliga fram- och mellanhjärnan. I kombination med upptäckten av delade transkriptomiska mekanismer förknippade med aggression (4), lärde vokaliseringar hos fåglar och människor (5), och kastdifferentiering i hymenoptera (7), de resultat som presenteras här utökar avsevärt vår förståelse av hur beteendemångfald utvecklas.