Шукати докази репродуктивної ситості в Дрозофіла, одиноких самців, які були ізольовані від самок на 3–6 днів, поміщали у харчові флакони, що містили ~25 незайманих самок, та перевіряли на предмет шлюбної поведінки (залицяння або спалювання) кожні 30 хвилин. Спочатку самці проводили приблизно 80% свого часу на шлюбну поведінку (залицяння та спаровування), але відсоток поступово знизився до ~10% протягом 4 годин (Фігури 1А і S1A, доступно в Інтернеті). Під час аналізу самці спаровувалися в середньому 3.3 ± 0.3 рази із середньою тривалістю копуляції 24.6 ± 0.4 хв, яка не змінювалася при повторних спарюваннях. Ми використовуємо термін насичення, щоб відобразити схильність до шлюбної поведінки, що поступово зменшується, у міру просування аналізу. Щоб кількісно оцінити цю зміну, ми обчислюємо індекс насичення: частка, на яку поведінка спарювання зменшується за останні 60 хвилин щодо перших 60 хвилин аналізу, що становить 0.82 ± 0.02 для мух дикого типу (рисунки 1A і 1B; подивитися Експериментальні процедури). Міцна репродуктивна ситість спостерігається на рівні як залицяння (індекс насичення 0.96 ± 0.02; малюнок 1C), так і спалювання (індекс насичення 0.82 ± 0.03; малюнок 1D). На відміну від інших аспектів шлюбної поведінки самців, на ситість не впливає попередній соціальний досвід самця з іншими самцями (Данкерт та ін., 2009,Інагакі та ін., 2014,Кім та ін., 2012) (Рисунок S1B).

малюнок 1Репродуктивна ситість у самців мух

Насичення не є результатом звикання до присутності самок, а вимагає спалювання. Запобігання копуляції шляхом використання самок з низькою чутливістю (Накаяма та ін., 1997), або чоловіки, які мають фізичні дефекти зовнішніх статевих органів (Кастрільон та ін., 1993), призвело до високого рівня залицяння, який підтримувався протягом усього аналізу насичення (рисунки 1E та S1D). Зменшення шлюбної поведінки, помічене наприкінці аналізу, не змінювалося шляхом поміщення ситого самця до свіжих незайманих самок (Малюнок 1F), але поступово відновлювався протягом 3–4 днів, якщо самця видаляли від самок (Малюнок 1F ). Зменшення потягу до спарювання у ситих самців також було помічено в стандартних аналізах залицяння (один самець і одна жінка в 15-хвилинному аналізі, які використовували протягом усього цього дослідження під час аналізу на гіпосексуальність; див. Експериментальні процедури) (Малюнки 1G та 1H). Коли ситі самці залицялися, вони витрачали порівнянну частину часу залицяння, виконуючи односторонню вібрацію крил (“співання”), але їхнє залицяння часто було тимчасовим (рисунки 1G та 1I). Насичення навряд чи є наслідком фізичного виснаження, оскільки рухова активність не змінилася після завершення аналізу насичення (рис. 1J). Ми робимо висновок, що подібно до ссавців (Пляж і Йорданія, 1956), чоловік Дрозофіла демонструють тимчасову репродуктивну ситість, викликану спарюванням, що є ознакою сексуальної мотивації.

Репродуктивна ситість відбувається паралельно зі зниженням репродуктивної здатності самця після повторних спарювання. Ця знижена потенція очевидна у самців, які нещодавно завершили аналіз насичення, оскільки їх подальші спалювання призводять до невеликої кількості, якщо взагалі є, потомства (Фігура 1К) (також дивКрікмор і Восшалл, 2013,Лефевр і Йонссон, 1962,Лінклейтер та ін., 2007). Фізична основа цього зниження фертильності знаходиться в сім’явиверому чоловікові, в якому містяться зрілі сперма та насіннєва рідина (Демерек, 1950 рік). Обсяг цибулини поступово зменшується під час повторних спарювання, а кінетика нагадує зниження шлюбної поведінки (Фігура 1L). До кінця аналізу насичення репродуктивні рідини значною мірою виснажені, а просвіт цибулини значно зменшився, що є імовірною причиною порушення фертильності самців у стані репродуктивного насичення. Наповненість цибулини відновлюється після аналізу насичення, хоча лише до ~75% через 3 дні від самок (Фігура 1М).

Оскільки парний диск приблизно відстежує об’єм еякулятора, ми запитали, чи використовується інформація про об’єм цибулини для контролю виконання сексуальної поведінки. Щоб дозволити копуляцію, але запобігти виснаженню репродуктивної рідини з цибулини, ми провели модифікований аналіз насичення, в якому копуляції були штучно припинені через 5 хвилин після початку — до перенесення репродуктивних рідин (Крікмор і Восшалл, 2013,Гілкрист і Партрідж, 2000,Тейлер та ін., 2012). Як і очікувалося, еякуляторна цибулина залишається повною протягом цього модифікованого аналізу (Малюнок 2A). Несподівано, однак, ми виявили, що усічені копуляції викликають насичення в тій же мірі, що і звичайні копуляції: кількість спарювання на самця в дослідженні залишилася незмінною, коли копуляції були порушені через 5 хвилин (Малюнок 2B), незважаючи на кумулятивний час, проведений у копуляції. різко зменшено (Малюнок 2C). Нормальна ситість у самців з усіченими спалюваннями також спостерігається в аналізі залицяння (Малюнок 2D). Потім ми дослідили наслідки штучного спорожнення цибулини сім’явиверження, не дозволяючи чоловіку спалюватися. Термогенетична активація нейронів коразоніну (crz) викликає повторну еякуляцію, навіть за відсутності копуляції (Тейлер та ін., 2012). Еякуляторні цибулини самців, в яких теплочутливий катіонний канал TrpA1 (Хамада та ін., 2008) було націлено на нейрони crz (crz > TrpA1) були виснажені після інкубації при 30°C протягом 3 днів, але це лікування не вплинуло на поведінку залицяння (Малюнок 2E). Більше того, відновлення потягу до спаровування після аналізу насичення було безперешкодним шляхом штучного підтримання порожнього статусу еякуляторної цибулини (Малюнок 2E). Висновок про те, що наповненість цибулини сім’явиверження повністю відокремлюється від енергійності залицяння, узгоджується з кінетикою відстроченого відновлення наповненості цибулини в порівнянні з спарюванням (Малюнок 1M). Разом ці результати заперечують пряму роль накопичення або виснаження сперми та насінної рідини в інструктуванні потягу до спарювання. Щоб запитати, чи грають репродуктивні органи якусь роль у гострому визначенні потягу до спарювання, ми хірургічним шляхом видалили задню частину живота, яка містить внутрішні та зовнішні репродуктивні органи. Ця операція не мала серйозного негативного впливу на залицяння у наївних чоловіків і не стимулювала залицяння у ситих чоловіків (Малюнок 2F; Фільм S1). Ці результати показують, що хоча парний потяг відкалібрований, щоб відображати репродуктивну здатність, самі репродуктивні органи не мають гострого впливу на реакцію самця на подання незайманої самки. Хоча сенсорна інформація від геніталій може свідчити про початок копуляції, в результаті коригування та підтримка парного потягу здійснюється в ЦНС.

Визначити гени та нейрони, які контролюють шлюбний потяг у самців Дрозофіла, ми дослідили понад 1,500 генетичних маніпуляцій (див Експериментальні процедури) в аналізі насичення для пошуку тварин, які підтримували високий рівень шлюбної поведінки після повторних копуляцій. Єдиний удар, отриманий на цьому екрані, став результатом термогенетичної активації дофамінергічних нейронів. Коли дофамінергічні нейрони стимулювали наприкінці аналізу насичення за допомогою тирозингідроксилази-Gal4 (TH > TrpA1; TH є ферментом, необхідним для синтезу дофаміну), ситі самці демонстрували різке відновлення в шлюбній поведінці (Малюнок 3A). Відскок спостерігається як у совокупленні (зниження насичення на 58%), так і в залицянні (зниження насичення на 84%) (рисунки S2A і S2B). Цей висновок відповідає попередній роботі, яка показує, що дофамінергічні нейрони вентрального нервового канатика (VNC) сприяють мотивації самців підтримувати окремі напади копуляції (Крікмор і Восшалл, 2013). У цьому дослідженні дофамінергічна функція була локалізована в VNC через здатність TshGal80 (який пригнічує активність Gal4 в більшості нейронів VNC) блокувати Gal4-опосередковані фенотипи. Навпаки, TshGal80 не впливає на зміну насичення, що спостерігається у чоловіків TH > TrpA1 (рис. 3A, S2A і S2B). Разом ці висновки виявляють дві функціонально та анатомічно відмінні ролі дофаміну у сприянні спарюванню у мух. Початковий потяг до спаровування встановлюється дофаміновими нейронами мозку, і після початку копуляції дофамінергічні нейрони VNC визначають стійкість і тривалість спарювання.

Щоб визначити, які дофамінергічні нейрони мозку лежать в основі потягу до спарювання, ми термогенетично активували чотири підгрупи дофамінергічних нейронів, використовуючи лінії Gal4, отримані з енхансерних елементів блідий локус, який кодує TH (Liu et al., 2012). Стимуляція будь-якої з двох підгруп нейронів TH (TH-C' і TH-D'; малюнки 3B і 3C) призвела до часткового відновлення від насичення. Ця зміна насичення не є вторинним ефектом збільшення рухливості, оскільки стимуляція будь-якої популяції не впливає суттєво на базальну активність (рис. S3A). Активність нейронів у цих популяціях необхідна для спарювання, оскільки специфічне для дорослих приглушення нейронів TH-C' або TH-D' з калієвим каналом Kir2.1 зменшило залицяння (рис. 3D). Сам дофамін, ймовірно, є стимулюючим сигналом спарювання, оскільки зниження виробництва TH в нейронах TH-C' або TH-D' з блідим RNAi різко зменшує залицяння (рис. S4).

Щоб запитати, чи знаходяться дофамінергічні нейрони спарювання в ланцюзі Fruitless, ми представили трансген Gal80, модель експресії якого опосередковано контролюється цис-регуляторні елементи безрезультатний (див. легенду на малюнку 3В). Термогенетична стимуляція у цих мух (TH-C' > TrpA1; FruGal80 і TH-D' > TrpA1; FruGal80) не може повернути насичення (Малюнок 3B), стверджуючи, що дофамінові нейрони спарювання є безплідними. Як в TH-C', так і в TH-D', FruGal80 блокував активність Gal4 в одному нейроні на півкулю мозку, і в обох випадках цей нейрон був розташований у дофамінергічному кластері PAL (Mao and Davis, 2009) (рис. 3E та S5). . У дорослих нейрони TH-C' або TH-D' не забарвлюються антитілами Fruitless (дані не показані), але в обох популяціях трансген FLP-рекомбінази вставлений в безрезультатний локус (FruFLP) ідентифікує окремі дофамінергічні нейрони, що належать до дофамінергічного кластеру PAL (Фігура 3F) (Келеман та ін., 2012, Мао і Девіс, 2009). Цей нейрон називається aSP4 (Келеман та ін., 2012, Ю та ін., 2010) і, як було показано, погіршує поведінку залицяння при фемінізації у чоловіків (фон Філіпсборн та ін., 2014). TH-F і TH-G не позначають нейрони в кластері PAL, включаючи aSP4 (Лю та ін., 2012). aSP4 проектує кілька дорсальних областей мозку (фон Філіпсборн та ін., 2014), включаючи передню частину верхнього медіального протоцеребра (SMPa) (Іто та ін., 2014) (Малюнок 3F).

Хоча активація aSP4 необхідна для зворотного насичення в цій системі, вона не виявляється достатньою, оскільки термогенетична активація VT02857-Gal4, яка спрямована на aSP4 (Келеман та ін., 2012), не підвищив шлюбну поведінку у ситих самців (Малюнок 3G), навіть коли дві копії Gal4 були використані для збільшення експресії (дані не показані). Це свідчить про існування інших дофамінергічних нейронів, які працюють з aSP4, щоб стимулювати спарювання. Тому ми перевірили ∼30 ліній Gal4, що мітять дофамінергічні нейрони, шукаючи лінії, які могли б подолати насичення при активації разом з aSP4. Ми ідентифікували NP5945-Gal4 (Kuo et al., 2015), який не позначає aSP4 і не змінював відчуття ситості при стимуляції окремо, але підвищував шлюбну поведінку ситих самців при стимуляції разом із VT02857 (Малюнок 3G). Приглушення нейронів VT02857 або NP5945 у дорослих за допомогою Kir2.1 знизило поведінку залицяння (Малюнок 3H), що свідчить про те, що спільна активність цих двох популяцій нейронів необхідна для сприяння нормальному наростанню потягу до спарювання. NP5945 позначає дофамінергічні нейрони без плодів у чотирьох кластерах (PPL2ab, PPL2c, PPM2 і PPM3) і має проекції до SMPa (Малюнок 3I). Хоча в даний час ми не можемо виділити нейрони всередині NP5945, які сприяють спарюванню, разом з aSP4, наші результати припускають, що SMPa є локусом для дофамінергічного контролю сексуальної мотивації у чоловіків.

Як перший крок до визначення нейронних мішеней передачі сигналів дофаміну, що мають відношення до спарювання, ми дослідили залицяння у тварин, які несуть мутації в чотирьох Дрозофіла дофамінові рецептори. При тестуванні у віці 3 днів комбінація мутацій у трьох рецепторах показала нормальний рівень залицяння, тоді як делеція четвертого, DopR2 (D1-подібний рецептор) (Хан та ін., 1996,Келеман та ін., 2012), призвело до різкого зниження залицяння без впливу на локомоторну активність (рис. 4A та S3B). Спочатку здавалося, що ці дані суперечать попереднім дослідженням, які повідомляли про нормальний рівень залицяння у цих самих мутантів DopR2 з тим же генетичним фоном (Келеман та ін., 2012). Подальше вивчення цих мутантів привело нас до ймовірного пояснення цієї невідповідності: ми виявили, що парний потяг у тварин DopR2 поступово збільшувався протягом 10–15 днів (Малюнок 4B), як і в меншій мірі, парний потяг у диких тварин. самці типу (Малюнок S1C). Це говорить про те, що в міру того, як потяг до спаровування збільшується з віком, додаткові дофамінові рецептори поступово стають здатними приймати сигнал спонукання. DopR2 функціонує в нейронах (на відміну від ненейрональних клітин), щоб сприяти своєчасному накопиченню сполучуваного драйву, оскільки нокдаун DopR2 за допомогою пан-нейронального драйвера elav-Gal4 фенокопіював делеційний мутант (рис. 4C). Парування за участю 3-денних самців-мутантів DopR2 були повністю плідними (дані не показані), тому поведінковий фенотип не є вторинним наслідком безпліддя.

У схемі Fruitless велика увага зосереджена на локусі, що складається з ~40 нейронів, який називається P1, який необхідний для спарювання (фон Філіпсборн та ін., 2011). Було показано, що стимуляція підгрупи нейронів P1 (позначена лінією Gal4 R71G01, іменована тут як P1-B у зв'язку з лабораторією Бейкера, де вона була вперше охарактеризована) стимулює поведінку залицяння до рухомих неживих об'єктів розміром із муху (Кохацу і Ямамото, 2015,Пан та ін., 2012). У наших руках активація нейронів P1-B викликає стійке залицяння навіть до нерухомих шматочків гумової стрічки, якщо вони пофарбовані в чорний колір (Малюнок 5A; Фільм S2). Цей фенотип відрізняється від активації всієї безплідної ланцюга, яка викликає залицяння за відсутності цілі (Малюнок S6A), і від активації дофамінових нейронів, яка не викликає залицяння за неживими об’єктами (Малюнок 5A).

На основі анатомії та схеми підключення Fruitless лабораторія Діксона припустила, що дофаміновий нейрон aSP4 може з’єднуватися з нейронами P1 (фон Філіпсборн та ін., 2014,Ю та ін., 2010). Ми виявили, що активація нейронів P1-B стимулює міцне залицяння у ситих чоловіків (Фігура 5B), а також у 3-денних самців, у яких відсутній DopR2 (Малюнок 5C). Таким чином, активація нейронів P1 обходить вимогу щодо залежного від стану дофамінергічного входу, що вказує на те, що вони функціонально знаходяться за потоком сигналу приводу дофаміну.

Чи є нейрони P1 прямими мішенями дофамінергічної передачі сигналів? Як зазначає лабораторія Діксона (фон Філіпсборн та ін., 2014,Ю та ін., 2010), спільне мічення нейронів P1-B і дофамінергічних нейронів (Малюнок 5D) показує змішування нейронних процесів між цими двома популяціями. Ми виявили сильний GRASP (відновлення GFP між синаптичними партнерами) (Файнберг та ін., 2008) сигнал між двома популяціями, що вказує на потенційні місця синаптичного зв’язку (рисунки 5E та S6B). Значна частина сигналу GRASP була розташована в SMPa, області, на яку націлений дофамінергічний нейрон aSP4 (Малюнок 3F), а також нейрони NP5945 (Малюнок 3I). Коли ми знищили DopR2 в нейронах P1, ми побачили значне зниження поведінки залицяння, яке відновлювалося з віком (Малюнок 5G), фенокопуючи мутант DopR2. Це є вагомим доказом того, що нейрони P1 отримують сигнал дофамінергічного приводу спарювання.

Лінія P1-B Gal4 позначає деякі клітини за межами статево диморфного кластера P1 (Пан та ін., 2012). Коли вводиться FruGal80, мічення P1-B в кластері P1 значно зменшується, але на експресію за межами кластера це явно не впливає (Малюнок 5F). Знищення DopR2 в цих нейронах, що залишилися, не вплинуло на поведінку залицяння (Малюнок 5H), що підтверджує, що P1-нейрони з позитивним результатом Fruitless отримують та інтерпретують сигнал дофаміну. Щоб запитати, чи отримують додаткові нейрони сигнал сполучення через DopR2, ми заблокували активність Gal4 в нейронах P1-B (див. Фігура 5I легенда) одночасно збиваючи DopR2 у всіх інших нейронах. Блокування пан-нейронального нокдауну DopR2 в нейронах P1-B відновило залицяння до нормального рівня (Малюнок 5I), стверджуючи, що сигнал дофамінергічного приводу спарювання приймається виключно P1.

Імовірні синаптичні контакти між дофамінергічними нейронами і нейронами P1 в області SMPa привели нас до моніторингу активності дофамінових нейронів у цій області у чоловіків різного репродуктивного стану. Ми загнали датчик кальцію GCaMP6s (Чен та ін., 2013) в дофамінергічних нейронах і виявили, що рівні флуоресценції в SMPa відстежують рівень насичення чоловіків. Подібно до спарювання, рівні флуоресценції поступово знижувалися протягом аналізу до такої міри, що вони знижувалися приблизно на 80% через 4.5 години (Фігури 6А і 6В). Також подібно до потягу до спарювання, дофамінергічна активність в SMPa поступово відновлювалася після аналізу насичення протягом 3 днів ізоляції від самок (Малюнок 6B). На нейрон aSP4 припадає більша частина дофамінергічної активності в SMPa, оскільки FruGal80 блокує ~65% флуоресценції у наївних тварин (Малюнок 6C). Флуоресценція помітно не змінювалася з історією спарювання в непов’язаній області, зоровій частці (Малюнок 6A), або в сусідньому нейропілі, медіальній частці тіла гриба (Малюнок 6B). Також не спостерігалися зміни флуоресценції SMPa у нечутливому до кальцію флуоресцентному білку tdTomato (p > 0.95) або при імунному фарбуванні фіксованого мозку TH > GCaMP6s (p > 0.92) (рисунки S7A та S7B). Залежна від історії спарювання зміна флуоресценції GCaMP6s у SMPa також була виявлена ​​за допомогою VT02857-Gal4, який позначає aSP4 та кілька інших дофамінергічних нейронів (Малюнок 6D) (Келеман та ін., 2012,Ю та ін., 2010), а також NP5945-Gal4, який позначає нейрони в чотирьох дофамінергічних кластерах (рисунки 6E та 3I) (Куо та ін., 2015). Ці результати показують, що дофамінергічна активність поблизу з’єднання з нейронами P1 служить нейронним корелятом потягу до спарювання самців.

Знижена базальна активність дофамінергічних проекцій в SMPa свідчить про те, що ці нейрони можуть стати менш збудливими після повторних спарювання. Щоб перевірити цю ідею безпосередньо, ми запустили чутливий до червоного світла іонний канал CsChrimson (Hoopfer et al., 2015,Клапоетке та ін., 2014) разом з GCaMP6s у дофамінергічних нейронах та використав двофотонну мікроскопію для зображення оптогенетично індукованих кальцієвих перехідних процесів у SMPa. При будь-якій тривалості стимуляції піки дофамінергічної флуоресценції SMPa були нижчими в наситому мозку, ніж у наївному мозку, або в мозку, тестованому через 3 дні після завершення аналізу насичення (Фігури 6F і 6G). Кінетика затухання флуоресценції не змінювалася з історією спарювання (Фігура 6H). Таким чином, спаровування зменшує збудливість та/або приплив кальцію дофамінергічних нейронів, що проекції SMPa, залишаючи при цьому властивості кальцію буферними незмінними. Ці тривалі зміни свідчать про молекулярний механізм, що діє або на входи дофамінових нейронів, або всередині самих дофамінових нейронів. Результуючий дофаміновий тон в SMPa служить нейронним корелятом потягу до спарювання, регулюючи активацію нейронів P1 у відповідь на сенсорну стимуляцію самок.

Аналіз на залицяння проводили та записували на відео в циліндричних камерах для залицяння (діаметром 10 мм і висотою 3 мм) при 23°C та вологості навколишнього середовища. Якщо не вказано інше, самця мухи (3–6 днів) поєднували з aw¹¹¹⁸ незаймана самка мухи в кожній камері. Індекс залицяння оцінювався вручну як частка часу, протягом якого самець мухи займався шлюбною поведінкою (залицяння та спаровування) протягом 5 хвилин після того, як самець мухи почав залицятися. У цій статті ми вручну підрахували оцінки залицяння, щоб узгоджуватися з оцінкою залицяння в аналізах насичення, чиє 3D-середовище та велика кількість тварин ускладнюють автоматичне підрахунок балів. Приступ залицяння вважався розпочатим, коли самець орієнтувався на самку, почав стежити за нею і в односторонньому порядку простягнув крило, щоб заспівати їй. Поєдинок вважався закінченим, якщо самець не співав протягом наступних 30 с або відвернувся від самки. Якщо самець мухи не залицявся протягом перших 15 хвилин кожного аналізу, індекс залицяння оцінювався як 0. Використовуючи ці критерії, два експериментатори (MAC і SXZ) зазвичай давали майже ідентичні індекси залицяння в пілотних дослідженнях. Ті ж критерії були застосовані при створенні етограм на малюнку 1G, де відсоток часу співу під час залицяння розраховували як time_spent_singing/total_time_spent_courting × 100%. У термогенетичних експериментах аналізи залицяння проводили спочатку при 23°C, а потім знову при вищій температурі. Для експериментів з tubGal80^ts (Малюнки 3D і 3H), самців мух переміщали до 30°C після вигоряння (Малюнок 3D) або через 1 день після утворення пупарію (Малюнок 3H) і тримали там (ізольовано від самок) до безпосереднього аналізу, який відбувся о 23. °C. Для експериментів із мутантами DopR2 або нокдауном RNAi використовували лише 3-денних самців, щоб уникнути незрозумілих ефектів віку. The DopR2^аттп тварини раніше були інтрогресовані в дикого типу Canton-S фон (Келеман та ін., 2012), який служив фоновим контролем дикого типу в наших поведінкових експериментах. Щоб додатково забезпечити узгодженість фону, ми повторно схрещували мутанта у фоні Canton-S ще тричі, не вплинувши на залицяння. Тому ми об’єднали дані про залицяння до та після другої інтрогресії.

Дослідження пересування проводили в циліндричних камерах (діаметр 30 мм і висота 3 мм) при 23°C і вологості навколишнього середовища. Самців Canton-S (3–6 днів), половина з яких щойно завершили аналіз насичення, окремо обережно аспірували в камери та дозволяли досліджувати камери протягом 1 хвилини, перш ніж їх пересування було записано стандартною відеокамерою на 30 fps протягом 10 хв. Сегментація та відстеження відео здійснювали за допомогою FIJI (Шинделін та ін., 2012) за допомогою плагіна MTrack2 (http://valelab.ucsf.edu/∼nstuurman/ijplugins/MTrack2.html).

Мозки мух видаляли в PBS або середовищі Шнайдера (ThermoFisher, 21720-024) і негайно фіксували в PBST і 4% параформальдегіді при кімнатній температурі протягом 20 хв. Після триразового промивання PBST (по 20 хв) мозок інкубували з первинними антитілами (розведеними в PBST) при 4°C протягом 48 годин. Після промивання PBST (тричі по 20 хвилин) мозок інкубували з вторинними антитілами (розведеними в PBST) при 4°C протягом 48 годин. Після ще трьох промивань PBST (по 20 хвилин кожне) мозок монтували за допомогою VectaShield (Vector Labs) на предметне скло за стандартними процедурами. Конфокальні зрізи були отримані за допомогою мікроскопа Olympus Fluoview 1000 або мікроскопа Olympus Fluoview 1200 з інтервалами 3–5 мкм, а максимальні проекції стеків зображень були отримані на FIJI (Шинделін та ін., 2012).

У 3-8-денних самців розсікали мозок мух у зовнішньому фізіологічному розчині (Вілсон і Лоран, 2005) і встановлений передньою стороною вниз на основу чашки Петрі зі скляним дном (MatTek, P35G-1.5-20-C), що містить 4 мл статичного зовнішнього фізіологічного розчину. Для стабілізації зразків оптичні часточки приклеювали до покривного скла за допомогою УФ-клею (Kemxert, KOA 300), затверденого за допомогою фіолетової лазерної указки потужністю 5 мВт (Oxlasers, OX-B005). Щоб отримати зображення SMPa, чотири-сім конфокальних зрізів, що охоплюють цю область, були отримані за допомогою мікроскопа Olympus Fluoview 1000 з інтервалом 3 мкм, а максимальні проекції стеків зображень були отримані на FIJI (Шинделін та ін., 2012). Після того, як один з нас (SXZ) зробив знімки, інший з нас (DR, незрячий до лікування) вибрав області інтересу (ROI) іпсилатерального SMPa, медіальної частки тіла гриба та фону (біля вускової частки, де є проекції дофаміну sparse) за допомогою каналу tdTomato (рисунки 6B, 6D та 6E) або каналу GCaMP6s (рисунок 6C). Розміри ROI залишалися приблизно однаковими між зразками. Середня флуоресценція пікселів у кожній ROI була розрахована за допомогою спеціально написаної програми MATLAB (Mathworks). Нормовану флуоресценцію розраховували як (GCaMP6s_SMPa − GcaMP6s_background)/(tdTomato_SMPa − tdTomato_background). Така ж формула була використана і для медіальної частки тіла гриба. Програма доступна за запитом.

Двофотонна лазерна скануюча мікроскопія була виконана за допомогою спеціального мікроскопа, як описано раніше (Картер і Сабатіні, 2004). Незабаром після еклосії мух перенесли у флакони, що містили регідратовані картопляні пластівці (Carolina Biological Supply, 173200) і 100 мкл повністю транс-ретинального вихідного розчину (Sigma, R2500; 35 мМ в етанолі). Усі досліди проводили з дорослими самцями мух протягом 3–6 днів після виторгнення. Перед візуалізації мозок мух ретельно розсікали в умовах слабкого освітлення та встановлювали задньою стороною вниз на покриту чашку Петрі (Thermo Scientific, 150318), що містить 3 мл фізіологічного розчину HL3.1 (Фен та ін., 2004). GCaMP6s збуджували на 920 нм і 11.8 мВт на зразку, і світло збирали в 128 × 128 кадрів при 256 мс на кадр. Базальний рівень активації CsChrimson, що залежить від сітківки, спостерігався при 920 нм (і на всіх довжинах хвиль, випробуваних від 860 до 940 нм), який зазвичай досягав плато протягом перших 20 кадрів (~5 с). У кадрі № 24 імпульс червоного світла (655 нм) доставлявся за допомогою світлодіода (Luxeon Star LEDs, LXM3-PD01-0350), який приводився в рух BuckPuck потужністю 720 мВт (Luxdrive, 3021-DE-700), і колімований лінзою (Carclo, 13193) на відстані ~3 см від зразка. Під час стимуляції дані про флуоресценцію не збиралися, щоб захистити фотопомножувач. Для кожної експериментальної серії подавалися світлові імпульси різної ширини в зростаючому, спадному або випадковому порядку. Дані флуоресценції були проаналізовані в MATLAB за допомогою напівавтоматизованої програми, модифікованої на основі опублікованого алгоритму аналізу незалежного компонента (Мукамель та ін., 2009). Період напіврозпаду ecay був оцінений шляхом підбору даних про розпад флуоресценції з одноекспоненціальною функцією. Усі постійні часу, виміряні на малюнку 6H, довші, ніж у самого GCaMP6 (<1.2 с у Дрозофіла) (Чен та ін., 2013). Програма доступна за запитом.