Manlike seksuele begeerte neem gewoonlik af met veroudering. Ons begrip van die neurobiologiese basis vir hierdie verskynsel word egter beperk deur ons kennis van die breinkringloop en neuronale weë wat manlike seksuele begeerte beheer. 'N Aantal studies oor spesies dui daarop dat dopamien (DA) seksuele begeerte beïnvloed. Hier gebruik ons ​​genetiese instrumente en gedragstoetse om 'n nuwe subgroep van DA-neurone te identifiseer wat ouderdomsverwante manlike hofaktiwiteit in Drosophila. Ons vind dat die verhoging van DA-vlakke in 'n subset van selle in die PPL2ab neuronale groep noodsaaklik en voldoende is vir 'n verhoogde volgehoue ​​hofmakery by jong en bejaarde manlike vlieë. Ons resultate dui daarop dat die voorkoming van die ouderdomsverwante daling in DA-vlakke in PPL2ab-neurone die verminderde hofgedrag by mans verlig Drosophila. Hierdie resultate kan die grondslag vorm vir die ontsyfering van die stroombane wat betrokke is by seksuele motivering by die man Drosophila brain.

Dopamine (DA) speel 'n belangrike rol in motoriese beheer¹, motivering^2,3, sirkadiaan⁴, kognisie^2,5 en beloon³. Die regulering van seksuele bevrediging deur soogdiere deur die DA is ook goed beskryf^6,7,8. Bewyse dat DA bemiddel reguleer seksuele gedrag van mense kom ook uit gevalle van onbedoelde hiperseksualiteit as gevolg van DA-behandeling by pasiënte met Parkinson-siekte⁹. Ondanks hierdie vooruitgang in ons begrip van die rol van die DA in die beheer van seksuele begeerte by soogdiere, is die neurobiologiese basis van hierdie verskynsel op sellulêre en kringvlak beperk.

Seksuele funksie neem gewoonlik af op ouderdom^10,11,12. Veroudering word gekenmerk deur fisiologiese, patologiese, gedrags- en psigososiale veranderinge. Al hierdie faktore beïnvloed seksuele funksie, en dit is moeilik om hul individuele effekte te ontwrig. Die sellulêre en molekulêre meganismes onderliggend aan seksuele agteruitgang met ouderdom was moeilik om te bestudeer en is steeds swak verstaanbaar. Vooruitgang in genetiese en gedragsinstrumente beskikbaar vir studie Drosophila, tesame met 'n meer gedetailleerde begrip van Drosophila hofmakery, het nou kragtige metodes gebied om die belangrikste funksies en reguleringsmeganismes van seksualiteit by hierdie diere te bestudeer.

Vorige studies met behulp van Drosophila demonstreer dat verskillende fisiologiese funksies, insluitend hofgedrag, deur ouderdom beïnvloed word^13,14,15. in die Drosophila brein, daar is ~280 DA neurone waarvan die selliggame in ten minste 13 groepe ingedeel is¹⁶. Ons het gedink dat hierdie DA-neurone subpopulasies sou bevat wat seksualiteit reguleer, en dus 'n kragtige model sou wees om te verstaan ​​hoe manlike seksuele reaksies deur DA-weë in die brein oor die leeftyd gereguleer word. Hier demonstreer ons dat DA-vlakke in die protoserebrale posteriolaterale dopaminerge clusterneuron 2ab (PPL2ab) manlike hofmakery reguleer en dat tyrosine hydroxylase (TH), 'n ensiem wat verantwoordelik is vir DA-sintese, die vlakke in hierdie selle met ouderdom daal. Interessant genoeg het die verandering van DA-vlakke in spesifieke PPL2ab-neurone geen invloed gehad op motoriese aktiwiteit, sensoriese prosessering (reuk en smaak ingesluit nie), en ook nie die lewensduur daarvan nie, wat daarop dui dat PPL2ab-neurone spesifiek manlike seksualiteit reguleer. Tesame dui ons resultate op 'n neurobiologiese meganisme vir die agteruitgang van seksualiteit by veroudering en bevorder ons begrip van hoe die brein manlike libido-vlakke en seksuele motivering reguleer.

PPL2ab neurone reguleer seksualiteit by manlike vlieë

Om die spesifieke DA-neurone wat reguleer, te bepaal Drosophilaons het Gal4-bestuurders gebruik om DA-aktiwiteit in beperkte groepe DAergiese neurone in die vliegbrein te manipuleer (Aanvullende Fig. 1; murashka-1-Gal4 bestuurder in Fig. 2a; en saamgevat in Aanvullende Tabel 1). Daarna het ons die effek van seltipe-spesifieke DA-uitdrukking op hofintensiteit by manlike vlieë geanaliseer (Fig 1). Ons resultate het getoon dat toenemende uitdrukking van TH in TH-Gal4-(Ref. 17) en TH-C1-Gal4-positiewe¹⁸ neurone het die manlike hofmakingsindeks aansienlik verbeter (Fig 1). Interessant genoeg het ons soortgelyke resultate waargeneem deur TH in te veel uit te druk murashka-1-Gal4-positiewe neurone, wat 'n meer beperkte selpopulasie teiken (Fig 1). Om die selle wat deur geteiken word, te benoem TH-Gal4, TH-C1-Gal4 en murashka-1-Gal4, ons het elke lyn na die UAS-mCD8 :: GFP verslaggewer reël en teenvoeter elk deur TH immunohistochemie. Deur die anatomiese profiel van TH-selle te evalueer wat GFP in elke lyn saamdruk, het ons gevind dat die uitdrukking oorvleuel tussen die drie Gal4-drywers in 'n subset van DA-neurone in die PPL2ab (Fig. 2a1 en Aanvullende Fig. 1g1) en die protoserebrale posteriomediale dopaminerge clusterneuron 1/2 (PPM1 / 2) (Fig. 2a2 en Aanvullende Fig. 1g3). Hierdie data het voorgestel dat die intensiteit van manlike hofmakery gereguleer kan word deur die vrylating van die DA van hierdie neurone.

Om vas te stel of PPL2ab- of PPM1 / 2-neurone betrokke is by manlike hofmakery, het ons die effek van selektiewe ooruitdrukking van TH en GFP van twee Gal4-drywers en een LexA-drywer in hierdie streke ondersoek. Ons het dit gevind NP3024-Gal4 en NP5945-Gal4 is gedeeltelik uitgedruk in die PPL2ab- en PPM1 / 2-groepe (Fig. 2b, c), terwyl LG121-LEXA is slegs uitgedruk in die PPL2ab-groep (Fig. 2d). Ons het waargeneem dat die selliggame van die PPL2ab-neurone wat deur hierdie drywers gemerk is, op die laterale rand van die protocerebrum naby die optiese lobbe geleë was (aangedui deur pyle in Fig. 2a-d), en geprojekteerde stygende neurale vesels na die kelk (CX) en die syhoring (LH) geprojekteer. TH-positiewe PPL2ab neurone is gemerk deur vier onafhanklike drywers wat in hierdie studie gebruik is (murashka-1-Gal4, NP5945-Gal4, NP3024-Gal4 en LG121-LEXA) (Figuur 2a1 – d1), en dit is belangrik dat die uitdrukkingspatrone van hierdie vier drywers slegs in PPL2ab-neurone oorvleuel. Om vas te stel of hierdie PPL2ab neurone hofgedrag reguleer, het ons TH met elke bestuurder te veel geëkspressueer en gedragsondersoeke uitgevoer. Ons het gesien hoe 'n aansienlike toename in die hofmakingsindeks en die lengte van die hofmakery in die rigting van óf ongeskonde óf onthoofde (dit wil sê geïmmobiliseerde vroue) teikenwyfies in alle lyne is (eenrigting ANOVA gevolg deur Tukey se toets, P<0.05) (Fig. 2e, f). Die gebruik van onthoofde teikenwyfies bied 'n metode om te evalueer of manlike seksuele aantrekkingskrag en verhoogde hofmakery gereguleer word deur verhoogde DA-vlakke in PPL2ab neurone. Deur die gebruik van 'n geïmmobiliseerde vroulike vrou, het ons die wederkerige gevolge van manlike-vroulike interaksies verwyder. Ons resultate demonstreer dus dat PPL2ab neurone spesifiek die intensiteit van manlike hofmakery deur die DA beïnvloed het, eerder as hul aantreklikheid.

Daar is ongeveer ses neurone in die PPL2ab-cluster in elke breinhemisfeer, wat in vorige studies¹³ is in ten minste vier subtipes geklassifiseer op grond van hul veselinerversies. Twee subtipes PPL2ab neurone projekteer na die ipsilaterale CX en LH; een baar die hele LH binne, terwyl die ander slegs die ventrale gedeelte binnedring. 'N Ander subtipe innerlik die lobula en brei 'n dorso-mediale tak uit wat langs die posterior optiese baan (POT) beweeg en naby die rugkant van die slukderm loop. Die oorblywende subtipe innerlik die posterior laterale protocerebrum¹³. Van die PPL2ab bestuurderlyne wat ons gebruik het, is drie (NP3024-Gal4, NP5945-Gal4 en LG121-LEXA) het verskillende POT-spooruitdrukkingspatrone vertoon (aangedui deur pylkop in Fig. 2b – d), terwyl murashka-1-Gal4 is nie in die POT uitgedruk nie. Dit impliseer dat PPL2ab-innerings van die POT moontlik sou wees om die intensiteit van manlike hofmakery te reguleer.

Om te bevestig watter ander subtipes PPL2ab neurone waarskynlik nodig is vir manlike hofmakery, is die murashka-1-Gal4 lyn is gebruik om die UAS>CD2, y⁺> CD8 :: GFP transgen gekombineer met 'n HS-FLP transgene. Twee verskillende subtipes PPL2ab neurone in murashka-1-Gal4 is ontsyfer in uitkloonklone (Fig. 2g, h). Een van die klone bevat selle met stygende takke van neuriete wat die CX binnedring, en 'n tweede tak neuriete wat die hele LH en 'n superieure mediale protocerebrum vererger (Fig. 2g; Aanvullende film 1). 'N Ander kloon van selle het een tak van primêre neuriete na die CX geprojekteer, en 'n ander tak na die aangrensende posterior inferior laterale protocerebrum en die ventrale deel van die LH; 'n derde tak het mediaal geprojekteer en die middelste inferior mediale protocerebrum binnegedring (Fig. 2h; Aanvullende film 2). Hierdie anatomiese uitdrukkingsdata, in oorleg met ons gedragsresultate, word aangedui dat die verhoogde DA-vlakke in 'n subset van murashka-1-Gal4 die uitdrukking van PPL2ab-neurone in hierdie streke hou verband met hofmakery by jong volwassenes (10 dae oud).

DA-vlakke beïnvloed hofmakery by bejaarde vlieë

Senescence is 'n verskynsel wat mettertyd 'n afname in fisiologiese funksies behels as gevolg van die nadelige newe-effekte van die deurlopende metaboliese reaksies in 'n lewende liggaam. Daar is berig dat veroudering seksualiteit en seksuele begeerte beïnvloed¹⁰. Om te bepaal of hofmakery gehandhaaf word as Drosophila ouderdom, het ons hofmakerygedrag by mans van verskillende soorte Canton S (CS) op verskillende ouderdomme (5–60 dae ouderdom) geanaliseer en gevind dat die maksimum hoflikheidsindeks en lengte van hofmakery op die ouderdom van 10 dae by volwasse mans voorgekom het (Aanvullende Fig. 2a, b). Die resultate het ook aan die lig gebring dat die handhawing van hofmakery geleidelik afgeneem het veroudering vanaf die maksimum op 10 dae oud. Aangesien motoriese aktiwiteit en hofaktiwiteit intiem verwant is, het ons motoriese aktiwiteite geassosieer met ouderdom by vlieë ondersoek. Negatiewe gravitaktiese gedragsanalise ('n klimtoets)¹⁹het getoon dat die klimaktiwiteit oor die grootste deel van die leeftyd voortduur voordat dit in 50-dae-oue manlike vlieë daal (Aanvullende Fig. 2c). Ons het die Drosophila aktiwiteitsmonitering (DAM) stelsel²⁰ om spontane motoriese aktiwiteite van 10- en 40-dae-oue mans vir 24 uur op te teken en te demonstreer dat daar geen noemenswaardige verskille tussen die twee groepe waargeneem is nie (Aanvullende Fig. 2d). Daar is egter 'n meer as tienvoudige verlaging van die DA-vlak in weefselmonsters van die koppe van 10 dae oue mans waargeneem, in vergelyking met tien dae oue mans (Aanvullende Fig. 3a, b). Ons het toe bevestig deur TH-immunostainings dat TH-proteïenvlakke in PPL2ab neurone by ouer mans verlaag is (Aanvullende Fig. 3c). Daarbenewens was die getalle PPL2ab neurone dieselfde by bejaarde vlieë, wat daarop dui dat hierdie neurone nie verouder het tydens veroudering nie (Aanvullende Fig. 3d). Ons het dus gedemonstreer dat DA-vlakke in die vliegbrein geleidelik met toenemende ouderdom afgeneem het, insluitend in PPL2ab-neurone. Dit was opmerklik, ten minste in die PPL2ab-groepe, nie die resultaat van ouderdomsverwante neuronale degenerasie in die veertigjarige ouderdomsvlieënier nie.

Om die effek van verhoogde DA-vlakke by bejaarde vlieë op hofmakery te ondersoek, het ons 35 dae oue vlieë gevoer met L-3,4-dihidroksyfenielalanien (L-DOPA; die voorloper vir DA-sintese) vir 5 dae en toetsing van hofmakery op dag 40. Interessant genoeg is hofmakery by vlieë wat gevoer is, getoets L-DOPA is beduidend op 'n dosisafhanklike manier gereguleer in vergelyking met die kontrole (tweerigting ANOVA gevolg deur 'n Bonferroni meervoudige vergelykings toets, P<0.05). Ooreenkomstig is die hoflikheidsindeks en die lengte van die hofmakery aansienlik verhoog in lêers wat gevoer is L-DOPA (tweerigtingvariansie-analise (ANOVA) gevolg deur 'n Bonferroni-meervoudige vergelykings-toets, P<0.05) (Fig. 3a, b). Om 'n neuronspesifieke toetsing van die gevolge van verhoogde DA-uitdrukking uit te voer, het ons ekstra TH-produksie, en dus meer DA-sintese, by DAergiese neurone by 35 dae oue mans veroorsaak deur dwelmgevoelige mutantvlieë wat met die LexPR/LexAop geenuitdrukkingstegniek²¹ (UAS-LexPR; TH-Gal4>LexAop-TH) (Fig. 3c) 1.5 mM RU486 vir 5 dae. Ons het gevind dat die hofmakingsindeks en die lengte van hofmakery van 40 dae oue mans aansienlik verhoog is in dwelmbehandelde vlieë (Fig. 3d, e). In teenstelling hiermee, toe ons die DA-funksie belemmer deur volwasse vlieë met α-metiel-p-tyrosine (AMPT) of 3-iod-tyrosine (3IY) (albei kragtige remmers van TH) en reserpine (Res; 'n remmer van vesikulêre monoamientransporteur) vir 5 dae, het ons 'n duidelike verlaging in die hofmakingsindeks en die lengte van die hofmakery gesien (tweerigting ANOVA gevolg deur 'n Bonferroni meervoudige vergelykings toets, P<0.05) (Fig. 3f, g ). In vlieë wat dieselfde geneskakelaarstelsel het, het ons die DA-produksie by jong vlieë ontwrig deur RNAi-bemiddelde uitklophou van th transgeen in DAergiese neurone (UAS-LexPR; TH-Gal4>LexAop-thRNAi) (Fig. 3h), en dit het die gevolge van die toediening van DA-remmers fenokopieer (tweerigting ANOVA gevolg deur 'n Bonferroni-meervoudige vergelykings-toets, P<0.05) (Fig. 3i, j). Tesame dui hierdie data aan dat die DA vrylating van TH-Gal4-positiewe neurone is nodig en voldoende om sterk manlike hofmakery te bevorder.

PPL2ab neurone moduleer manlike seksualiteit by bejaarde vlieë

Ons wonder of die verminderde hofmakery by ouer manlike vlieë moontlik herstel kan word deur die DA-vlakke in PPL2ab-neurone te verhoog. Ons het DA-uitdrukking in PPL2ab neurone tydelik geïnduseer vanaf dag 35 tot 40 post-eclosion en toetsing van hofmakery in die 40 dae oue vlieë (Fig. 4a), het ons gevind dat die hoflikheidsindeks en die lengte van die hofmakery aansienlik verhoog is by ouer mans (tweerigting-ANOVA gevolg deur 'n Bonferroni-meervoudige vergelykings-toets, P<0.05) (Fig. 4b, c). In teenstelling hiermee, toe ons afgereguleerde DA-vlakke in PPL2ab-neurone geïnduseer het vanaf dag 5 tot 10 na eklusie en getoetsvermoë by tien dae oue vlieë getoets het (Fig. 4d), het ons 'n beduidende afname in beide die hoflikheidsindeks en die lengte van die hofmakery by volwasse mans waargeneem (tweerigting ANOVA gevolg deur 'n Bonferroni-toets vir meervoudige vergelykings, P<0.05) (Fig. 4e, f). Daar was 'n nie-noemenswaardige neiging om die lengte van hofmakery te verminder na die onthoofde teikenwyfie in vlieë met onderregulering th in LG121 neurone teenoor die kontrolegroep (tweerigting ANOVA gevolg deur 'n Bonferroni meervoudige vergelykings toets, P> 0.05).

Om verder te bevestig dat die bogenoemde resultate volledig verklaar kan word deur DA-seine, het ons verskeie kontrole- en neuronale aktiwiteitsondersoeke uitgevoer. Die doeltreffendheid van alle TH-effekte wat in hierdie studie gebruik is, is bevestig met RT-qPCR en TH-immuunbevattende metodes, en in elke geval het ons 'n beduidende veranderlike hoeveelheid waargeneem th transkripsie en TH proteïen in vlieë (Aanvullende Fig. 4). Daarbenewens het ons ReaChR (rooi-aktiveerbare ChR) gebruik^22,23 om die aktiwiteit van PPL2ab neurone te moduleer deur fluoresserende rooi lig-ligte tydens ligvliegtuigassays. Geregtigheid in die hofmanskap is aansienlik verhoog in eksperimentele groepe met ligaktiverende PPL2ab neurone in vergelyking met die kontroles, in ooreenstemming met ons resultate wat verkry is deur die DA-vlak direk te verhoog (eenrigting ANOVA gevolg deur Tukey se toets, P<0.05) (Aanvullende Fig. 5). Verder het ons 'n beduidende verhoogde hofmakingsindeks en hoflengte by beide ongeskonde vrouens en onthoofde vroulike teikens waargeneem.

Twee pare PPL2ab neurone beïnvloed seksualiteit by ouer mans

Aangesien die uitdrukkingspatrone van die vier PPL2ab-drywers wat ons in hierdie studie gebruik het, redelik breed is en die vorige bevindings wat in ag neem dat PPL2ab-neurone funksioneer in die regulering van manlike seksuele volhoubaarheid, in ag geneem word, was die bewyse wat die eksperimente tot op hierdie punt gelewer het, slegs korrelatief. Daarom het ons 'n interseksionele genetiese strategie gebruik om presiese DA-vlakke van PPL2ab-neurone te manipuleer om oorsaak-en-gevolg-verwantskappe tussen die DA-vlakke van PPL2ab-neurone en hofmakery by manlike vlieë te vestig. Ons het spesifiek 'n LexA-geïnduseerde FLP toegepas/ FRT herkombinasie-metode wat geoptimaliseer is om geteikende TH-misexpressie te veroorsaak in 'n interseksionele streek wat gedefinieer word deur oorvleuelende GAL4- en FLPase-aktiwiteite (Fig. 5a). Hierdie strategie werk soos volg: FLPase wat deur LexA bestuur word, verwyder óf die FRT-stop-FRT (> *>) van UAS-FRT-stop-FRT-mCD8 :: GFP (UAS> *> GFP) of die FRT-stop-FRT (> *>) van UAS-FRT-stop-FRT-TH (UAS> *> TH) in LG121neurone uitdruk (Fig. 5b). dan, UAS-mCD8 :: GFP word slegs deur GAL4 geaktiveer in PPL2ab neurone wat geleë is in die streke wat deur albei geteiken word LG121-LEXA en murashka-1-Gal4 (LG121∩murashka-1) (Fig. 5c). Ons het toe hierdie vlieë gebruik vir verdere gedragstudies. Nadat ons interseksionele gerigtheid op spesifieke PPL2ab-neurone toegepas het, het ons gevind dat slegs twee pare TH-positiewe PPL2ab-neurone gemerk is deur UAS-mCD8 :: GFP. Oormatige uitdrukking van TH in hierdie twee pare PPL2ab-neurone het die hofmakingsindeks en hofmakery by 40 dae oue mans verbeter (eenrigting ANOVA gevolg deur Tukey se toets, P<0.05) (Fig. 5d, e). Hierdie resultate het die deelversameling van PPL2ab-neurone geïdentifiseer wat nodig en voldoende is vir DA-bemiddelde hofmakery.

Benewens die speel van 'n belangrike rol in die regulering van seksualiteit^6,8, DA reguleer ook ander noodsaaklike fisiologiese funksies in baie organismes, insluitend beweging¹, beloningsverwante antwoorde³, kognisie^2,5, aandag⁵, sirkadiese ritmes ⁴, motivering^2,3, leer en geheue²⁴. Vorige navorsing het bevestig dat die DA bydra tot baie funksies in vlieë^{18,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. In hierdie studie het ons beoog om die neurale stroombane te bepaal wat onderlê by die DA-regulering van hofmakery deur genetiese en farmakologiese manipulasies, tesame met gedragsassays.

Die hofmakingsindeks is 'n kwantitatiewe uitdrukking van die hofduur gemeet as die persentasie tyd wat aan elke hofperiode aan hofmakery bestee word. Daarom kwantifiseer dit die relatiewe hoeveelheid hofmakery. Lengte van hofstryd kwantifiseer die duur van die hoflikheidsfase, wat aandui in watter mate die hofperiode tussen hofmakery en nie-hofmakingsgedrag was. Daarom kan dit gebruik word as 'n aanduiding van hofkwaliteit. Ons bevindings het, kwantitatief en kwalitatief, 'n verbetering van die manlike hofmakery getoon toe DA-vlakke in PPL2ab-neurone verhoog is; ons het beduidende toenames in beide die hofindeks (kwantitatiewe verbetering) en die lengte van die hofmakery (kwalitatiewe verbetering) waargeneem. Aangesien hofintensiteit nie altyd die paringsgeneigdheid weerspieël nie, het ons konstant geen statisties beduidende verskille in paringsukseskoers waargeneem toe DA-vlakke in PPL2ab neurone by mans verhoog isAanvullende Fig. 6). In teenstelling hiermee, toe DA-vlakke in PPL2ab-neurone afgeneem is, het ons 'n beduidende afname in die hofmakingsindeks en die lengte van die hofmakery by mans gesien, aangedui deur 'n kwantitatiewe en kwalitatiewe belemmering van die hofmakery. Interessant genoeg was die vrylating van die DA van 'n subset van PPL2ab neurone voldoende om die handhawing van manlike hofmakery by nie net jong, maar ook bejaarde vlieë te verhoog. Daarbenewens het ons getoon dat DA-geassosieerde afnames in PPL2ab neurone gelei het tot ouderdomsverwante afname in seksualiteit by mans. Hierdie studie beklemtoon dus die belangrikheid van DA-vlakke in PPL2ab-neurone, wat 'n potensiële rol speel in die regulering van nuwe teen-senesesseprosesse wat verband hou met Drosophila manlike hofmakery.

Ondanks onlangse studies wat daarop dui dat vlieë met neurale DA-bewegings beweeg en sensoriese tekorte toon³⁵, het die verandering van DA-vlakke in die PPL2ab-neurone geen invloed gehad op motoriese aktiwiteit en sensoriese insette nie, insluitend die reuksintuie en die smaak, of selfs die lewensduur (eenrigting ANOVA gevolg deur Tukey se toets, P> 0.05) (Aanvullende Fig. 7). Dit impliseer dat PPL2ab neurone die manlike seksualiteit spesifiek kan reguleer.

Ons resultate het dus moontlik 'n spesifieke seksuele motiveringskring geopenbaar waarin PPL2ab neurone manlike seksuele gedrag reguleer deur onbekende stroomaf neurone via DA-seine. Die verhouding van hierdie neurone tot seksueel dimorfe neurone soos die wat uitdruk vrugtelose (FRU) gene waarborg verdere studie, veral as ons in ag neem dat ons gegewens daarop dui dat daar oorvleueling kan wees in die projeksies van vrug-uitdrukkende neurone en die PPL2ab-DA-uitdrukkende selle wat ons geïdentifiseer het. Vruguitdrukkende neuronale stroombane is nou gekoppel aan Drosophila manlike hofmakery³⁶, en vruguitdrukkende neurone word versprei in sensoriese, sentrale en motoriese stelsels^{37,38,39,40,41,42}. 'N Manlike spesifieke hofmakende remming begin in die Or67d sensoriese neurone wat die eksterne manlike spesifieke feromoon ontvang cis-vaccenylacetaat (cVA) van die DA1-projeksie neurone. Hierdie selle stuur dan inligting aan DC1 interneurone in die LH wat dan die cVA-geïnduseerde sein oordra na dalende DN1 neurone. Uiteindelik stuur DN1-neurone hul aksone na die torakale ganglion, wat die remming van mans veroorsaak^{43,44,45,46,47}. Dit is opmerklik dat al die neurone in hierdie stroombaan vrugpositief is. Daarbenewens bevat die manspesifieke P1-groep ook vrugpositiewe neurone, wat kragtige aktiveerders van manlike hofmakery is⁴⁸. Arbours van P1-neurone kan verbind word met P2b interneurone in die middelste superieure protocerebrum en strek dalende vesels na die torakale ganglia vir die vorming van hofmakingspatrone^48,49. In hierdie studie het ons gevind dat albei die subtipes PPL2ab geïdentifiseer in murashka-1 uitklapklone het hul neuriete op soortgelyke wyse as LH opgegrawe en een van die subtipes het vesels na die medium superieure protocerebrum geprojekteer (Fig. 2g, h). Op grond van hierdie waarnemings is dit moontlik dat PPL2ab neurone in wisselwerking is met die FruM-stroombaan. Daar is egter twee ander waarnemings wat daarop dui dat die PPL2ab-stroombaan veranderinge in hofaktiwiteit kan modifiseer, onafhanklik van FruM-neurone. Eerstens is daar nie geteiken deur TH-positiewe PPL2ab neurone nie FRU-Gal4 (Aanvullende Fig. 8a). Tweedens, aktiveer FRU-Gal4 neurone met ReaChR tydens die hofmakings het die hof nie gehandhaaf nie (eenrigting ANOVA gevolg deur Tukey se toets, P> 0.05) (Aanvullende Fig. 8b, c). Nietemin word die Fru-uitdrukkende stroombane wyd versprei in verskillende sensoriese, sentrale en motoriese stelsels. Verdere werk is nog nodig om hierdie probleem op te los. 'N Deeglike anatomiese opsporing van neurale stroombane wat van spesifieke PPL2ab-neurone afkomstig is, kan dus lig werp op die patroon van geslagspesifieke bedrading van 'n neurale stroombaan in die vliegbrein. Nietemin bied ons studie nuwe insig in die rolle van DA-sein in die regulering van manlike seksuele gedrag oor die leeftyd, wat die pogings om die seksuele brein te verstaan, bevorder.

Vliegstamme

Vliegvoorraad word op standaard koringmeelvoedsel verhoog en gehuisves op 25 ° C en 70% relatiewe humiditeit op 'n 12: 12 uur lig: donker siklus. Die wilde tipe stam wat gebruik is, was Canton-S w (CS10). Die GAL4- en LexA-drywerstamme wat gebruik is, was TH-Gal4 (Ref. 17), murashka-1-Gal4 (Ref. 50), c061-Gal4;MB-Gal80 (refs 27, 51), NP2758-Gal4 (refs 34, 51), NP1528-Gal4 (Ref. 27), MB-Gal80; krasavietz-Gal4 (Ref. 51), NP5272-Gal4 (Ref. 27), HL9-62-1N-Gal4en LG121-LEXA ('n geskenk van Ann-Shyn Chiang, NTHU, Taiwan), TH-C1-Gal4 (Ref. 18), TH-D1-Gal4 (Ref. 18) (geskenk van Mark Wu, Johns Hopkins Universiteit), NP3024-Gal4 en NP5945-Gal4 (# 113066, # 105062; gekoop by die Drosophila Genetiese hulpbronsentrum, Kyoto Instituut vir Tegnologie, Japan), UAS-thRNAi (# 108879; gekoop by die Wene Drosophila Bronnesentrum, Wene, Oostenryk). Die UAS- en LexAop-effektore wat gebruik is, was UAS-TH⁵², UAS-LexPR-attp40²¹, UAS-mCD8::CFP, UAS-ReaChR, LexAop-ReaChR (# 5137, # 5130, # 53748, # 53747; gekoop by die Bloomington Drosophila Aandelsentrum, Universiteit van Indiana, IN, VSA). Die LexAop-MKO en FRU-Gal4 ('n geskenk van Ann-Shyn Chiang, NTHU, Taiwan) en die LexAop-GeneSwitch-attp40 (Ref. 21) is verkry van die laboratoriums wat dit opgewek het. Ons laboratorium het die LexAop-de-attp2, LexAop-de-attp40, LexAop-thRNAi-attp2, LexAop-thRNAi-attp40, LexAop-FLP-attp3, UAS-FRT-stop-FRT-de-attp40 transgeniese lyne wat in hierdie studie gebruik is. In alle breinbeelde en gedragsanalise met behulp van transgeniese uitdrukking is die nageslag verkry vanaf die kruising van Gal4- of LexA-vlieë wat na die aangeduide verslaggewer of effektortransgen oorgedra is.

immunohistochemie

Die montering van die volledige brein van die volwasse brein is uitgevoer soos voorheen beskryf²¹. In kort is die gedissekteerde breine in 4% paraformaldehied vasgemaak in 0.01 M fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS) wat 30 minute op ys gelaat is voordat die disseksie begin het. Vervolgens word die breine oorgedra na penetrasie / blokkerende (P / B) buffer (2% Triton X-100, 0.02% NaN₃, en 10% normale bokserum in PBS) by kamertemperatuur en word 1 uur onder vakuum gehou. Vir immunohistochemiese kleuring het die primêre teenliggaampies 1:50 muis 4F3 anti-Discs groot teenliggaampie (anti-DLG) (Hybridoma Bank, Universiteit van Iowa) en 1: 1,000 rotte anti-tyrosine hidroksilase teenliggaampie (anti-TH, NB300-109, Novus Biologies) oornag by kamertemperatuur. Die sekondêre teenliggaampies het biotien-gekonjugeerde bok-anti-muis-IgG's (Invitrogen) en biotien-gekonjugeerde bok-anti-konyn-IgG's (Invitrogen) ingesluit wat 1: 200 verdun is. Biotien-gekonjugeerde IgGs is ondersoek deur Alexa Fluor streptavidin 633 (1: 1,000 700 verdunning, Invitrogeen). Immunostained breine is skoongemaak en in Focusclear gemonteer (CelExplorer Labs, Taiwan) en is met 'n Zeiss LSM40 Confocal Microscope onder 'n objektiewe lens van XNUMX × C-Apochromat geneem.

Enkele-neuronbeelding

Vir genetiese FLP-out-etikettering, vlieë wat die hs-flp; +; muraskha-GAL4 / UAS> rCD2, y⁺> mCD8::CFP transgeen is gedurende die vier dae van die pupalstadium gedurende 37 minute hitte geskok teen 4 ° C. Breinmonsters is geïnkubeer in 'n skemerkelkie van primêre teenliggaampies, waaronder 10: 1 konyn-anti-GFP (Molecular Probes) en 500:1 muis 50F4 anti-DLG oornag by kamertemperatuur. Na drie keer in PBS met 3% Triton X-2 (PBS-T) gewas het, is die monsters gedurende 100 dag by kamertemperatuur by kamertemperatuur geïnkubeer in 1: 250 biotinileerde bok-anti-muis of konyn IgG (Molecular Probes). Vervolgens word breinmonsters gewas en geïnkubeer in 'n skemerkelkoplossing, insluitend 1: 1 1,000 geit-anti-konyn Alexa Fluor 488 en 1: 1,000 Alexa Fluor 635 streptavidin (Molecular Probes) by kamertemperatuur oornag. Na uitgebreide was in PBS, is die breinmonsters skoongemaak en in Focusclear (CelExplorer Labs, Taiwan) aangebring vir beelding. Die monsterbreine is onder 'n Zeiss LSM700-konfokale mikroskoop met 'n objektieflens van 40 × C-Apochromat-waterbeeld ingeneem.

Hofstudie-toetsing

Naïewe mans met geen vooruitstrewende sosiale ervaring is op die dag van die uitlating versamel en in individuele proefbuise in 'n 25 ° C broeikas gehou met 'n 12 uur L / D-siklus. Teikenwyfies is in groepe geberg (byvoorbeeld 20 wyfies per flessie). Geregshulpbepalings is elke dag tussen uur 2 en uur 6 van die ligsiklus uitgevoer. In elke sel is 'n hofmakery (1.2 cm deursnee × 0.8 cm hoog) met 'n laag gisvoedsel saamgestel. Vlieë is blootgestel aan 'n ligte CO-vlak₂ vir tien minute om hulle te laat intobiliseer. Vervolgens is beide proefmans en teikenwyfies (10 dae na eklose) na elke kamer in die kamer oorgeplaas en die video wat opgeneem is (HDR-SR3 digitale videokamera, Sony, Japan) vir 10 minute. Die hofmakingsindeks is bepaal deur die persentasie tyd voor die observasieperiode van die kopulasie wat die toetser-mannetjie deurgebring het om die teikenwyfie te beoefen (dit wil sê, tik, volg, vlerkvibrasie en poging tot kopulasie)^53,54. Die gemiddelde lengte van die hofmakery (duur) is bereken as die tyd wat die mannetjie ononderbroke hofmakery spandeer het.

Statistiese analise

Statistiese ontledings is met behulp van SigmaPlot sagteware weergawe 12.0 uitgevoer. Alle data is geëvalueer via eenrigting-ANOVA, gevolg deur die kalkoen-toets of tweerigting-ANOVA, gevolg deur 'n Bonferroni-meervoudige vergelykingstoets. Die middele binne elke datastel gevolg deur dieselfde letters verskil nie op die 5% -vlak nie. Alle gegewens is aangebied as gemiddelde + sem

Bykomende metodes

Die besonderhede van transgenekonstruksie, die negatiewe gravitaxis-toets, proboscis-verlengingsrespons (PER) toets, die vermydingstoets en kwantitatiewe metings van DA deur HPLC-ECD word in die Aanvullende aanlynmetodes.